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1 June 2012 Detection and Differentiation of Avian Reoviruses Using SYBR-Green I–Based Two-Step Real-Time Reverse Transcription PCR with Melting Curve Analysis
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Abstract

A two-step SYBR-Green I–based real-time PCR with melting curve analysis was developed to detect and differentiate the avian reovirus (ARV) σC gene in field and vaccine ARVs. Three primer sets were used to amplify the σC gene from its 5′, center, and 3′ regions and analyze the melting point temperatures of nine ARVs. By combining the melting curves of the three ARV σC gene regions, melting curve analysis could accurately distinguish the ARVs of different subtypes, and the results were consistent with phylogenetic analysis. The ARV σC gene polymorphisms from different strains were also used to explain the differences in melting point temperatures. Compared with traditional subtyping methods, the current melting curve analysis provided an accurate test for separating ARVs, thereby making it a useful method for the improved selection of ARV vaccines.

Detección y diferenciación de reovirus aviares utilizando un método de transcripción reversa y PCR en tiempo real en dos pasos con análisis de la curva de fusión utilizando SYBR-Green I.

Se desarrolló un método de PCR en tiempo real en dos pasos basado en el análisis de las curvas de fusión con SYBR-Green I para detectar y diferenciar reovirus aviares mediante el gene sigma C de cepas de campo y de vacunas. Se utilizaron tres pares de iniciadores para amplificar el gene Sigma C desde las regiones del extremo 5′, el centro y el extremo 3′ y se analizaron las temperaturas de punto de fusión de nueve reovirus aviares. Mediante el análisis combinado de las curvas de fusión de las tres regiones del gene sigma C, el análisis de la curva de fusión pudo distinguir con precisión los diferentes subtipos de reovirus aviares, y los resultados fueron confirmados mediante el análisis filogenético. Los polimorfismos del gene C de diferentes cepas también fueron utilizados para explicar las diferencias en las temperaturas de punto de fusión. En comparación con los métodos tradicionales de subtipificación, este análisis de la curva de fusión, resultó ser una prueba exacta para clasificar los reovirus aviares, por lo tanto resultó ser un método útil para la selección más adecuadas vacunas contra reovirus aviares.

American Association of Avian Pathologists
Kejun Guo, Teresa Dormitorio, Shan-Cia Ou, and Joseph Giambrone "Detection and Differentiation of Avian Reoviruses Using SYBR-Green I–Based Two-Step Real-Time Reverse Transcription PCR with Melting Curve Analysis," Avian Diseases 56(2), 369-376, (1 June 2012). https://doi.org/10.1637/9692-022211-Reg.1
Received: 7 March 2011; Accepted: 1 January 2012; Published: 1 June 2012
JOURNAL ARTICLE
8 PAGES


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