La extracción apropiada de ADN en los insectos es un factor limitante debido a la presencia de inhibidores que afectan los estudios genéticos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y marcadores moleculares, por lo que es importante utilizar métodos que permitan obtener cantidades suficientes de ADN con alta pureza, calidad, y concentración. Se evaluaron cinco protocolos de extracción de ADN, CTAB, H. Guanidina, Buffer STE, Buffer de lisis y kit Qiagen, en larvas de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith). A partir del ADN obtenido, se evaluó calidad, pureza, concentración y costo, lo que permitió seleccionar la mejor metodología para identificación de biotipos del insecto plaga mediante PCR-RFLP. Las concentraciones promedio fueron 1158.5, 404, 610, 188.7 y 25.9 ng/μl para los métodos de extracción de ADN, CTAB, H. Guanidina, Buffer STE, Buffer de lisis, y kit Qiagen, respectivamente. El ADN obtenido con el Buffer STE presentó mayor cantidad de impurezas proteicas y restos celulares (A260/A280 = 1.37), seguido de Buffer de lisis, H. Guanidina, kit Qiagen, y CTAB (1.74, 2.13, 1.89, y 1.85). El kit Qiagen fue el mejor método de extracción en cuanto a pureza y calidad, pero mostró una concentración baja, mientras que con el método CTAB se obtuvo una concentración mayor y una pureza confiable, en ambos métodos se obtuvo el 100% en la amplificación de fragmentos de 569 pb del gen COI de S. frugiperda. Los mejores resultados se obtuvieron usando los métodos CTAB y kit Qiagen. El método CTAB es el recomendado en este estudio porque se obtiene una mayor concentración, calidad requerida, y bajo costo en la extracción del ADN, además de lograr la detección e identificación molecular de biotipos de gusano cogollero del maíz Spodoptera frugiperda colectados en Sinaloa, México. Todos los métodos de extracción del ADN evaluados, fueron eficaces para la identificación de los biotipos de gusano cogollero mediante análisis PCR-RFLP.