MicroRNA (miRNA) is a major family of small RNAs that posttranscriptionally regulate gene expression. Small RNA profiling studies have revealed that some viruses, particularly large DNA viruses, such as Marek's disease virus (MDV), encode their own set of miRNAs. There are currently 406 viral miRNAs in miRBase, of which 392 are encoded by herpesviruses. To date, 26 MDV-1 miRNAs, 36 MDV-2 miRNAs, and 28 herpesvirus of turkeys miRNAs have been identified. Interestingly, herpesvirus miRNAs appear to have spatial conservation, located in clusters within repeat regions, but lack sequence conservation. Two clusters of MDV-1 miRNA have been identified, one located near the MEQ gene and one within the latency-associated transcript (LAT). miRNA profiling studies have shown that MDV miRNA are differentially expressed between strains and stages of infection. For example, mdv1-miR-M4 and mdv1-miR-M2-3p are three- and sixfold higher, expressed, respectively, in vv strains compared to vv strains. A recent study found that deletion or seed region mutation of mdv1-miR-M4 reduces viral oncogenicity, suggesting a link between mdv1-mir-M4 and lymphoma development in MDV-infected birds. Taken together, current research suggests that viral miRNAs are a key component of MDV pathogenesis.

Estudio Recapitulativo—Estado actual de la investigación sobre micro ARN en la enfermedad de Marek.

Las moléculas de micro ARN (miRNA) son una familia de moléculas pequeñas de ARN que regulan de manera postranscripcional la expresión de genes. Los estudios de los perfiles de moléculas pequeñas de ARN han revelado que algunos virus, particularmente virus ADN grandes como el virus de Marek codifican su propio conjunto de micro ARN. Actualmente existen 406 moléculas de micro ARN en la base de datos miRBase, de las cuales 392 están codificadas por herpesvirus. Hasta la fecha, se han identificado 26 moléculas de micro ARN del virus de Marek 1, 36 del virus de Marek 2 y 28 del herpesvirus de pavos. De manera interesante, las moléculas de micro ARN de los herpesvirus parecen ser conservadas de manera espacial, localizados en grupos dentro de regiones repetidas, pero carecen de secuencias conservadas. Dos grupos del virus de Marek 1 han sido identificados, uno se encuentra localizado cerca del gene MEQ y otro dentro del transcripto asociado con la latencia (LAT). Los estudios de perfiles de micro ARN han demostrado que las moléculas de micro ARN del virus de la enfermedad de Marek se expresan de manera diferente de acuerdo a las cepas o al estado de infección. Por ejemplo, las moléculas mdv1-miR-M4 y mdv1-miR-M2-3p se expresan de tres y seis veces más, respectivamente en las cepas muy virulentas plus en comparación con las cepas muy virulentas. Un estudio reciente demostró que la deleción o una mutación en la región de la semilla de mdv1-miR-M4 reduce la oncogénesis viral, lo que sugiere un vínculo entre mdv1-mir-M4 y el desarrollo de linfomas en las aves infectadas con Marek. Considerando todo, la investigación reciente sugiere que las moléculas de micro ARN virales son un componente clave en la patogénesis de la enfermedad de Marek.

Marek's disease virus (MDV) is a highly contagious virus that induces T-lymphoma in chicken. This viral infection still circulates in poultry flocks despite the use of vaccines. With the emergence of new virulent strains in the field over time, MDV remains a serious threat to the poultry industry. More than 40 yr after MDV identification as a herpesvirus, the visualization and purification of fully enveloped infectious particles remain a challenge for biologists. The various strategies used to detect such hidden particles by electron microscopy are reviewed herein. It is now generally accepted that the production of cell-free virions only occurs in the feather follicle epithelium and is associated with viral, cellular, or both molecular determinants expressed in this tissue. This tissue is considered the only source of efficient virus shedding into the environment and therefore the origin of successful transmission in birds. In other avian tissues or permissive cell cultures, MDV replication only leads to a very low number of intracellular enveloped virions. In the absence of detectable extracellular enveloped virions in cell culture, the nature of the transmitted infectious material and its mechanisms of spread from cell to cell remain to be deciphered. An attempt is made to bring together the current knowledge on MDV morphogenesis and spread, and new approaches that could help understand MDV morphogenesis are discussed.

Estudio Recapitulativo—Morfogénesis del virus de la enfermedad de Marek.

El virus la enfermedad de Marek (con las siglas en inglés MDV) es un virus altamente contagioso que induce linfomas de células T en pollos. Esta infección viral todavía circula en las parvadas comerciales a pesar de la utilización de vacunas. Con el surgimiento de nuevas cepas virulentas en el campo a través del tiempo, el virus de Marek sigue siendo una amenaza grave para la industria avícola. Más de 40 años después de la identificación de este virus como un herpesvirus, la visualización y la purificación de partículas infecciosas completamente envueltas siguen siendo un reto para los biólogos. Las diversas estrategias utilizadas para detectar estas partículas ocultas por microscopía electrónica son revisadas en este artículo. Actualmente se acepta de manera general que la producción de viriones libres de células sólo se produce en el epitelio del folículo de la pluma y se asocia con determinantes moleculares del virus, de las células o de ambos expresados en este tejido. Este tejido se considera la única fuente para la diseminación eficaz del virus en el medio ambiente y por lo tanto el origen de la transmisión exitosa en las aves. En otros tejidos de aves o en cultivos de células permisivas, la replicación del virus de Marek sólo conduce a un número muy bajo de viriones envueltos intracelulares. En ausencia de viriones extracelulares con envoltura detectables en el cultivo celular, la naturaleza del material infeccioso de transmisión y sus mecanismos de propagación de célula a célula aún deben ser esclarecidos. Se hizo un intento de recopilar los conocimientos actuales sobre la morfogénesis del virus de Marek y su propagación, y se discuten los nuevos enfoques que podrían ayudar a comprender la morfogénesis de este virus.

Proteomics is the application of rapidly evolving high-throughput technologies that enable analysis of proteins on a large scale. Recent advances in instrumentation have allowed detection, identification, and quantification of proteins with unparalleled precision and reproducibility, and this, in combination with novel bioinformatics tools, has helped to move proteomics from the simple cataloging of expressed proteins toward discovery of operating mechanisms in the biological systems. Proteomics holds great promise for advancing the understanding of viral pathogenesis, immunity, and the dynamics of virus–host protein interactions. Nevertheless, only a small number of proteomic studies have been done on animal viruses and avian herpesviruses in particular. This review summarizes the basic concepts and technologies used in proteomics and highlights the most successful applications of different proteomic approaches that resulted in identification of new virus–host protein interactions, mechanisms of genetic resistance and susceptibility to Marek's disease in chickens, and profiling and analysis of proteomes of Gallid herpesvirus 2 (GaHV-2), GaHV-3, and Meleagrid herpesvirus 1 infected or transformed cells. This review also discusses current limitations and potential future applications of proteomic methods in avian herpesvirus research.

Estudio Recapitulativo—Proteómica aplicada a los herpesvirus aviares.

La proteómica es la aplicación de tecnologías de rápida evolución, con alto rendimiento que permiten el análisis de proteínas a gran escala. Los avances recientes en instrumentación han permitido la detección, identificación y cuantificación de proteínas con precisión y reproducibilidad sin precedentes, esto en combinación con nuevas herramientas bioinformáticas, lo que ha ayudado a la evolución de la proteómica, de la simple catalogación de las proteínas expresadas, hacia el descubrimiento de los mecanismos operativos en los sistemas biológicos. La proteómica promete el avance de la comprensión de la patogénesis viral, la inmunidad, y la dinámica de las interacciones entre los virus y las proteínas del huésped. Sin embargo, sólo un pequeño número de estudios de proteómica se han hecho en los virus animales y en los herpesvirus aviares en particular. Esta revisión resume los conceptos básicos y las tecnologías utilizadas en la proteómica y se resaltan las aplicaciones más exitosas de diferentes técnicas de proteómica que dieron lugar a la identificación de nuevas interacciones entre los virus y las proteínas del huésped, los mecanismos de resistencia genética y la susceptibilidad a la enfermedad de Marek en pollos, así como el desarrollo de perfiles y análisis de proteomas de células infectadas o transformadas por el herpesvirus de las gallinas 2 (GaHV-2), por el GaHV-3, o por el herpesvirus 1 de los pavos. Esta revisión también aborda las limitaciones actuales y las posibles aplicaciones futuras de los métodos de proteómica en la investigación de los herpesvirus aviares.

Despite the remarkable progress in our understanding of Marek's disease (MD) and the causative Marek's disease virus (MDV) biology, a number of major features of this complex viral disease remain unknown. Significant information on critical aspects of virus latency in lymphoid cells, and the virus-host interaction in MDV-induced lymphoma, remains to be identified. Moreover, the nature of the unique milieu of the feather follicle epithelial cell that allows cytolytic infection to continue, despite maintaining the latent infection in the lymphoid cells, is not fully understood. Although there has been significant progress in our understanding of the functions of a number of viral genes in the pathogenesis of the disease, the characteristics of the latent infection, how it differs from tumor phase, and whether latency is a prerequisite for the tumor phase are all important questions still to be answered. Reticuloendotheliosis virus-transformed cell lines have been shown to support MDV latency in a manner almost identical to that seen in MDV-transformed cell lines. There are increasing data on the role of epigenetic regulation, including DNA methylation and histone modifications, in maintaining viral latency. Onset of MD tumor is relatively rapid, and recent studies based on chromosomal integration and T-cell repertoire analysis demonstrated the clonal nature of MD lymphomas. Among the viral determinants of oncogenicity, the basic leucine zipper protein Meq is considered to be the most important and the most extensively studied. Deleting the Meq proteins or abolishing some of the important interactions does affect the oncogenicity of the virus. In addition, the noncoding sequences in the viral genome, such as the viral telomerase RNA and the virus-encoded microRNAs, also have significant influence on MDV-encoded oncogenesis.

Estudio Recapitulativo—Latencia y tumorigénesis en la enfermedad de Marek.

A pesar de los notables avances en la comprensión de la enfermedad de Marek (MD) y en la biología del virus (MDV) causante de esta enfermedad, continúa sin conocerse una serie de características principales de esta compleja enfermedad viral. La información relevante a los aspectos críticos de la latencia del virus en las células linfoides, y la interacción virus-huésped en los linfomas inducidos por este virus, aún están por identificar. Además, la naturaleza del microambiente especial en la célula epitelial folículo de la pluma que permite la continuación de la infección citolítica, a pesar de mantener la infección latente en las células linfoides, no se entiende completamente. Aunque ha habido avances significativos en el conocimiento acerca de las funciones de un número de genes virales en la patogénesis de la enfermedad, las características de la infección latente, el cómo esta fase se diferencia de fase de tumores, y si la latencia es un requisito previo para la fase de tumor, son cuestiones importantes que siguen sin respuesta. Se ha demostrado que la latencia del virus de Marek se presenta en las líneas celulares transformadas por el virus de la reticuloendoteliosis de una manera casi idéntica a la observada en líneas celulares transformadas por el virus de Marek. Cada vez hay más datos sobre el papel de la regulación epigenética, incluyendo la metilación del ADN y las modificaciones de las histonas en el mantenimiento de la latencia viral. El inicio de la fase tumoral en la enfermedad de Marek es relativamente rápido, y los estudios recientes basados en la integración cromosómica y en el análisis del repertorio de células T, han demostrado la naturaleza clonal de los linfomas en la enfermedad de Marek. Entre los determinantes virales de oncogenicidad, la proteína básica con una cremallera de leucinas llamada Meq se considera que es el determinante más importante y el más ampliamente estudiado. La eliminación de las proteínas meq o

The epidermal growth factor receptor (EGFR), a growth-factor-receptor tyrosine kinase, is up-regulated in numerous tumors, which provides a good target for cancer therapy. Although it has been documented that oncoviruses are responsible for the activation of EGFR in tumors, the impact of Marek's disease virus (MDV) infection on EGFR has not yet been studied. We performed quantitative reverse transcriptase (RT)-PCR to check EGFR expression and found that it was significantly down-regulated after MDV infection. To explore the mechanism of EGFR repression, we examined the level of methylation of the EGFR promoter. The methylation level was significantly increased at 21 days postinfection, indicating a potential role of promoter methylation in EGFR repression.

La metilación del ADN disminuye la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en los pollos.

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (con las siglas en inglés EGFR), que es un receptor de un factor de crecimiento del tipo quinasa de tirosina, está regulado para su aumento en numerosos tumores, lo que lo convierte en un buen objetivo para la terapia contra el cáncer. Aunque se ha documentado que los oncovirus son responsables de la activación de EGFR en tumores, el impacto de la infección por el virus de la enfermedad de Marek (MDV), sobre el EGFR aún no ha sido estudiado. Se llevó a cabo una técnica de transcriptasa inversa y PCR cuantitativo (RT-PCR) para comprobar la expresión del EGFR y se encontró que era regulado hacia su disminución de manera significativa después de la infección por el virus de Marek. Para explorar el mecanismo de represión del EGFR, se examinó el nivel de metilación del promotor del EGFR. El nivel de metilación aumentó significativamente a los 21 días después de la infección, lo que indica un posible papel de la metilación del promotor en la represión del EGFR.

It is well established that herpesviruses encode numerous microRNAs (miRNAs) and that these virally encoded small RNAs play multiple roles in infection. The present study was undertaken to determine how co-infection of a pathogenic MDV serotype one (MDV1) strain (MD5) and a vaccine strain (herpesvirus of turkeys [HVT]) alters viral miRNA expression in vivo. We first used small RNA deep sequencing to identify MDV1-encoded miRNAs that are expressed in tumorigenic spleens of MDV1-infected birds. The expression patterns of these miRNAs were then further assessed at an early time point (7 days postinfection [dpi]) and a late time point (42 dpi) in birds with and without HVT vaccination using real-time PCR (RT-PCR). Additionally, the effect of MDV1 co-infection on HVT-encoded miRNAs was determined using RT-PCR. A diverse population of miRNAs was expressed in MDV-induced tumorigenic spleens at 42 dpi, with 18 of the 26 known mature miRNAs represented. Of these, both mdv1-miR-M4-5p and mdv1-miR-M2-3p were the most highly expressed miRNAs. RT-PCR analysis further revealed that nine MDV miRNAs were differentially expressed between 7 dpi and 42 dpi infected spleens. At 7 dpi, three miRNAs were differentially expressed between the spleens of birds co-infected with HVT and MD5 compared with birds singly infected with MD5, whereas at 42 dpi, nine miRNAs were differentially expressed. At 7 dpi, the expression of seven HVT-encoded miRNAs was affected in the spleens of co-infected birds compared with birds only receiving the HVT vaccine. At 42 dpi, six HVT-encoded miRNAs were differentially expressed between the two groups. Target prediction analysis suggests that these differentially expressed viral miRNAs are involved in regulating several cellular processes, including cell proliferation and the adaptive immune response.

La interacción entre el virus de Marek y el herpesvirus de los pavos afecta a la expresión de micro ARN viral.

Está bien establecido que los herpesvirus codifican numerosos micro ARN (con las siglas en inglés miRNAs) y que estas pequeñas moléculas de ARN codificadas viralmente juegan múltiples papeles en la infección. El presente estudio se realizó para determinar como la co-infección entre una cepa patógena (MD5) del virus de Marek serotipo 1 (MDV1) y una cepa vacunal (herpesvirus de los pavos [HVT]) altera la expresión de los genes micro ARN viral in vivo. Se utilizó por primera vez la secuenciación profunda de moléculas pequeñas de ARN para identificar micro ARN codificado por el virus de Marek serotipo 1 que se expresan en los bazos con tumores en las aves infectadas por el virus de Marek 1. Los patrones de expresión de micro ARN fueron valorados mediante PCR en tiempo real (RT-PCR), de manera temprana (7 días después de la infección) y tardíamente (42 días después de la infección) en las aves con y sin vacunación con el herpesvirus de los pavos. Además se determinó el efecto de la co-infección con el virus de Marek serotipo 1 sobre el micro ARN codificado por el herpesvirus de los pavos mediante PCR en tiempo real. Se expresó una población diversa de micro ARN en los bazos con tumores inducidos por el virus de Marek a los 42 días después de la infección, con 18 micro ARNs maduros representados de los 26. De éstos, tanto el mdv1-miR-M4-5p y el mdv1-miR-M2-3p fueron los micro ARN más expresados. El análisis por PCR en tiempo real reveló que nueve micro ARN del virus de Marek se expresan diferencialmente entre 7 y 42 días después de la infección en los bazos infectados. A los siete días después de la infección, tres micro ARN fueron expresados diferencialmente en los bazos de las aves co-infectadas con el herpesvirus de los pavos y la cepa MD5 en comparación con las aves infectadas con el virus MD5 por separado

The propagation of herpesvirus genomes as infectious bacterial artificial chromosomes (iBAC) has enabled the application of highly efficient strategies to investigate gene function across the genome. One of these strategies, transposition, has been used successfully on a number of herpesvirus iBACs to generate libraries of gene disruption mutants. Gene deletion studies aimed at determining the dispensable gene repertoire of the Meleagrid herpesvirus 1 (MeHV-1) genome to enhance the utility of this virus as a vaccine vector have been conducted in this report. A MeHV-1 iBAC was used in combination with the Tn5 and MuA transposition systems in an attempt to generate MeHV-1 gene interruption libraries. However, these studies demonstrated that Tn5 transposition events into the MeHV-1 genome occurred at unexpectedly low frequencies. Furthermore, characterization of genomic locations of the rare Tn5 transposon insertion events indicated a nonrandom distribution within the viral genome, with seven of the 24 insertions occurring within the gene encoding infected cell protein 4. Although insertion events with the MuA system occurred at higher frequency compared with the Tn5 system, fewer insertion events were generated than has previously been reported with this system. The characterization and distribution of these MeHV-1 iBAC transposed mutants is discussed at both the nucleotide and genomic level, and the properties of the MeHV-1 genome that could influence transposition frequency are discussed.

El genoma del herpesvirus de los pavos 1 es parcialmente resistente a la transposición.

La propagación de los genomas de herpesvirus dentro de cromosomas bacterianos artificiales (con las siglas en inglés iBAC) ha permitido la aplicación de estrategias altamente eficientes para investigar la función de los genes en todo el genoma. Una de estas estrategias, que es la transposición, se ha utilizado exitosamente con varios herpesvirus propagados dentro de cromosomas bacterianos artificiales para generar bibliotecas de mutantes con genes interrumpidos. En este trabajo se realizaron estudios mediante la supresión de genes con el objetivo de determinar el repertorio de genes prescindibles del genoma del herpesvirus de los pavos 1 (MeHV-1), con el fin de aumentar la utilidad de este virus como una vacuna recombinante. Se utilizó un herpesvirus de los pavos 1 propagado en un cromosoma bacteriano artificial en combinación con los sistemas de transposición Tn5 y MuA en un intento por generar librerías de herpesvirus de pavos con genes interrumpidos. Sin embargo, estos estudios han demostrado que los eventos de transposición por el sistema Tn5 dentro del genoma de este herpesvirus se produjeron en frecuencias inesperadamente bajas. Además, la caracterización de las ubicaciones genómicas de estos raros eventos de inserción del transposón por Tn5 indicaron una distribución no aleatoria dentro del genoma viral, en donde siete de las 24 inserciones ocurrieron dentro del gene que codifica a ICP4. Aunque los eventos de inserción con el sistema de MuA ocurrieron con una frecuencia más alta en comparación con el sistema de Tn5, se generaron un menor número de eventos de inserción en comparación con los que previamente se habían informado con este sistema. La caracterización y distribución de estos mutantes del herpesvirus de los pavos propagados en cromosomas artificiales se discute tanto a nivel de nucleótidos como genómico, y también se discuten las propiedades del genoma del herpesvirus de los pavos 1 que podrían influir en la frecuencia de transposición.

In addition to tumors, Marek's disease (MD) virus (MDV) can induce a variety of syndromes linked to the central nervous system. In fact, early descriptions of MD suggested that it was a condition affecting mainly the nervous system. Cytokines and other immune-related genes have been suggested to play a crucial role in MDV-mediated neuropathology, but the mechanisms behind the viral-induced neurologic dysfunction are still poorly understood. In the present study we have used reverse genetic strategies to show that pp14 is not involved in the oncogenic phenotype of MDV1 and is not required for viral replication; however, we provide evidence indicating that the absence of pp14 expression is correlated with increased survival of MDV1-infected chickens, and that its expression is associated with enhanced viral neurovirulence. Our data identify for the first time pp14 as a neurovirulence factor from MDV1 and open the possibility to investigate the molecular mechanisms by which pp14 mediates the damage to the avian nervous system.

Identificación de un factor de neurovirulencia del virus de la enfermedad de Marek.

Además de tumores, el virus de la enfermedad de Marek (MDV) puede inducir una variedad de síndromes relacionados con el sistema nervioso central. De hecho, las primeras descripciones de la enfermedad de Marek sugirieron que era una enfermedad que afectaba principalmente el sistema nervioso. Se ha sugerido que las citocinas y otros genes relacionados con la inmunidad desempeñan un papel crucial en la neuropatología mediada por la enfermedad de Marek, pero los mecanismos que están implicados en la disfunción neurológica inducida por este virus todavía son poco conocidos. En el presente estudio se utilizaron estrategias de genética inversa para demostrar que el gene pp14 no está implicado en el fenotipo oncogénico del virus de Marek 1 y que no es necesario para la replicación viral. Sin embargo, se proporcionan pruebas que indican que la ausencia de la expresión de pp14 se correlaciona con aumento de la supervivencia de los pollos infectados con Marek, y que su expresión se asocia con un aumento en la neurovirulencia viral. Los presentes datos identifican por primera vez al producto pp14 como un factor de neurovirulencia del virus de Marek 1 y abren la posibilidad de investigar los mecanismos moleculares por los cuales el producto pp14 media los daños en el sistema nervioso aviar.

A genome-wide association study (GWAS) using Bayesian variable selection was performed to determine genomic regions associated with mortality due to Marek's disease virus (MDV) infection in layers. Mortality (%) under experimental disease challenge (500 plaque-forming units of a very virulent plus MDV strain) was recorded for progeny groups (average 15.5 birds; range 3 to 30) of 253 genotyped sires from four generations of a brown-egg layer line. An additional generation of 43 sires with progeny data was used to validate results. Sires were genotyped with a 42K Illumina single-nucleotide polymorphism (SNP) chip. Methods BayesB (π  =  0.995) and BayesCπ, with or without weighting residuals by the size of progeny groups were applied. The proportion of genetic variance contributed by SNPs within each 1-megabase (Mb) genomic region was quantified. Average mortality was 33% but differed significantly between generations. Genetic markers explained about 11% of phenotypic variation in mortality. Correlations between genomic estimated breeding values and percentage of progeny mortality for the validation generation (sons of individuals in training) were 0.12, 0.17, 0.02, and 0.16 for BayesB, weighted BayesB, BayesCπ, and weighted BayesCπ, respectively, when using the whole genome, and 0.03, 0.20, −0.06, and 0.14, when using only SNP from the 10, 1-Mb regions, explaining the largest proportion of genetic variance according to each method. Results suggest that regions on chromosomes 2, 3, 4, 9, 15, 18, and 21 are associated with Marek's disease resistance and can be used for selection and that accounting for the size of progeny groups has a large impact on correct localization of such genomic regions.

Estudio de asociación genómica para la mortalidad en gallinas de postura por la enfermedad de Marek.

Se realizó un análisis de asociación genómica mediante el método bayesiano para la selección de variables, con el fin de determinar las regiones genómicas asociadas con mortalidad debida al virus de la enfermedad de Marek en gallinas de postura. Se registraron los porcentajes de mortalidad después de una prueba de desafío experimental (500 unidades formadoras de placa de una cepa del virus de Marek muy virulento plus) en los grupos de progenie (15.5 aves promedio, con un rango 3 a 30) de 253 gallos tipificados genéticamente, por cuatro generaciones de una línea de aves productoras de huevo marrón. Una generación adicional de 43 gallos con datos de progenie se utilizó para validar los resultados. Los genotipos de los padres fueron obtenidos usando un chip de polimorfismo de base simple de 42K manufacturado por Illumina. Se aplicaron métodos bayesianos BayesB (π  =  0.995) y BayesCπ, con o sin residuales ponderados según el tamaño de los grupos de progenie. Se cuantificó la proporción de varianza genética explicada por polimorfismos de base simple por cada región genómica de 1 Mb, usando muestras bayesianas de efecto de los marcadores. La mortalidad promedio fue de 33%, la cual fue significativamente diferente entre generaciones. Los marcadores genéticos explicaron alrededor de un 11% de la variación en mortalidad. Las correlaciones entre valores genéticos genómicos estimados y mortalidad de la progenie (%) para la generación de validación (hijos de los individuos de las generaciones de entrenamiento con genotipo completo) fueron de 0.12, 0.17, 0.02, y 0.16 para los métodos de BayesB, BayesB ponderada, BayesCπ y BayesCπ ponderada, respectivamente, cuando se utilizo el genoma completo. Se obtuvieron valores de 0.03, 0.20, −0.06 y 0.14 utilizando sólo los polimorfismos de base simple de las 10 regiones principales de 1 Mb que explicaban la proporción más grande de variación genética de acuerdo con cada método. Los resultados sugieren que existen regiones en los cromosomas 2, 3, 4, 9, 15, 18 y 21 que están asociadas con la resistencia a la enfermedad de Marek y que pueden utilizarse p

Herpesvirus replication within host cells results in concatemeric genomic DNA, which is cleaved into unit-length genomes and packaged into the capsid by a complex of proteins. The sites of cleavage have been identified for many herpesviruses, and conserved signaling sequences involved in cleavage and packaging have been characterized. The cleavage/packaging motifs pac-1, pac-2, and DR1 and two distinct groups of telomeric repeat sequences (static TRS and variable TRS) have been identified. By sequencing the termini of the gallid herpesvirus type 2 (GaHV-2) strain CU-2, two different cleavage sites (classical and aberrant) have been identified. Unlike classical cleavage of human herpesvirus type 1, which occurs within the DR1 site, classical cleavage of the GaHV-2 concatemers occurs 8.5 bp upstream of the DR1 site and results in an S-terminus containing telomeric repeats. Aberrant cleavage occurs the same distance from the DR1 site and generates a telomeric S-terminus but an L-terminus lacking an a sequence. These results are consistent with previous findings in other herpesviruses and should prove useful in the future study and manipulation of the GaHV-2 genome.

Identificación y caracterización de las terminales genómicas y de las señales de disociación y de empaquetado del herpesvirus de las gallinas serotipo 2.

La replicación de los herpesvirus dentro de las células huésped resulta en la producción de ADN genómico concatémero, que se disocia en genomas de longitud unitaria y son empaquetados en la cápside por un complejo de proteínas. Los sitios de disociación se han identificado para varios herpesvirus, y se han caracterizado las secuencias conservadas de señalización implicadas en la disociación y en el empaquetado. Se han identificado los motivos de disociación y empaquetado pac-1, pac-2 y DR1 y dos grupos distintos de secuencias repetidas teloméricas (TRS estáticas y TRS variables). Mediante la secuenciación de los extremos del herpesvirus de las gallinas serotipo 2 (GaHV-2), cepa CU-2, se identificaron dos sitios de corte diferentes (uno clásico y otro aberrante). A diferencia de la disociación clásica de herpesvirus humano tipo 1, que se produce dentro del sitio DR1, la disociación clásica de los concatémeros del herpesvirus de las gallinas tipo 2 se produce a 8.5 pares de bases orientadas al extremo 5' del sitio DR1 y resulta en un S-terminal que contiene repeticiones teloméricas. La disociación aberrante se produce a la misma distancia del sitio DR1 y genera un S-terminal telomérico, pero un L-terminal que carece de una secuencia a. Estos resultados son consistentes con los resultados anteriores en otros herpesvirus y debería ser útil en el estudio futuro y la manipulación del genoma del herpesvirus de las gallinas serotipo 2.

In a previous study, vaccination with a live bivalent vaccine consisting of herpesvirus of turkeys (HVT) and SB-1 was found to be associated with distinct cytokine expression patterns and the modulation of cytokine responses in the spleen. This vaccine could play a role in mediating protection against infection with the RB1B strain of Marek's disease virus. In the present study, vectors for chicken Toll-like receptor 1 (chTLR1) and 2 (chTLR2) expression were constructed and transfected into Vero cells. Nuclear factor kappa light-chain enhancer of activated B cell (NF-κ;B) activation was detected after HVT infection. Compared with normal Vero cells, NF-κ;B activation was significantly inhibited by HVT in Vero cells transfected with chTLR1-1, chTLR1-2, or both. The results demonstrate the significant characteristics of HVT in activating TLR2 signaling. chTLR1 plays a key role in TLR2 subfamily–mediated NF-κ;B inhibition after HVT infection.

Inhibición de la activación del factor NF-κB mediado por el receptor tipo Toll 2 en células Vero con el herpesvirus de los pavos.

En un estudio anterior, se determinó que la vacunación con una vacuna viva bivalente constituida por el herpesvirus de los pavos (HVT) y el virus 1-SB estaba asociada con distintos patrones de expresión de citoquinas y con la modulación de las respuestas de citocinas en el bazo. Esta vacuna podría desempeñar un papel mediador de la protección contra la infección con la cepa RB1B del virus de la enfermedad de Marek (MDV). En el presente estudio, se construyeron vectores de expresión para los receptores tipo Toll 1 (chTLR1) y tipo Toll 2 (chTLR2) y se transfectaron en células Vero. Se detectó la activación del factor nuclear kappa potenciador de las cadenas ligeras de células B activadas (NF-κB) después de la infección con el virus HVT. En comparación con las células Vero normales, la activación del factor NF-κB fue inhibida significativamente por el virus HVT en las células Vero transfectadas con el vector chTLR1-1, o con el vector chTLR1-2, o con ambos. Los resultados ponen de manifiesto las características significativas del virus HVT en la activación de las señales por TLR2. El vector ChTLR1 juega un papel clave en la inhibición de la subfamilia TLR2 mediada por el factor NF-κB después de la infección por el virus HVT.

Herpesvirus envelope proteins are of particular interest for development of attenuated live, marker, and subunit vaccines, as well as development of diagnostic tools. The unique short genome region of the chicken pathogen infectious laryngotracheitis virus (ILTV, Gallid herpesvirus 1) contains a cluster of six conserved alphaherpesvirus genes encoding membrane proteins, of which up to now only glycoproteins gG and gJ have been analyzed in detail. We have now prepared monospecific rabbit antisera against ILTV gD, gE, and gI, and the ILTV type II membrane protein pUS9, each of which showed specific immunofluorescence reactions, and detected proteins of approximately 65 and 70 kDa (gD), 62 kDa (gI), 75 kDa (gE), or 37 kDa (pUS9) in western blot analyses of infected chicken cells. The proteins gD, gI, and gE, but not pUS9, were identified as abundant virion proteins, and gE and gI were shown to be N-glycosylated. We also isolated gE-, gI-, and pUS9-deleted ILTV recombinants, whereas it was not possible to purify gD-negative ILTV to homogeneity, indicating that gD, like in other alphaherpesviruses, is essential for receptor binding and virus entry. The pUS9-deleted ILTV exhibited almost wild-type–like replication properties in cell culture. The gE- and gI-negative viruses showed significantly reduced plaque sizes, whereas virus titers were barely affected. Since homologous gene-deletion mutants of other alphaherpesviruses are in use as live vaccines, the generated ILTV recombinants might be also suitable for this application.

Identificación y análisis funcional de las proteínas de membrana gD, gE, gI, y pUS9 del virus de la laringotraqueitis infecciosa.

Las proteínas de la envoltura de los herpesvirus son de particular interés para el desarrollo de vacunas con virus vivos atenuados, con marcadores, o de vacunas subunitarias, así como para el desarrollo de herramientas de diagnóstico. La región corta única del virus patógeno de la laringotraqueitis infecciosa del pollo (Herpesvirus de las gallinas 1, con las siglas en inglés ILTV) contiene un grupo de seis genes conservados de alfaherpesvirus que codifican para proteínas de membrana, de los cuales hasta ahora sólo las glicoproteínas gG y gJ se han analizado en detalle. Se prepararon antisueros de conejo monoespecíficos contra las proteínas de membrana del virus de laringotraquítis gD, gE, y gI, y contra la proteína de membrana del virus de laringotraqueítis tipo II pUS9, la cual mostró reacciones de inmunofluorescencia específicas, y se detectaron proteínas de aproximadamente 65 y 70 kDa (gD), de 62 kDa (gI), 75 kDa (gE), o de 37 kDa (pUS9) en los análisis de inmunoelectrotransferencia de las células de pollo infectadas. Las proteínas gD, gI y gE, con excepción de la pUS9, se identificaron como proteínas abundantes en el virión y las proteínas gE y gI mostraron estar N-glicosiladas. También se aislaron virus de laringotraqueítis recombinantes con los genes gE, gI y pUS9 suprimidos, mientras que no fue posible purificar virus de laringotraqueítis negativos a la presencia de gD, lo que indica que gD, como en otros alfaherpesvirus, es esencial para la unión al receptor y para la entrada del virus. El virus de laringotraqueítis con el gene pUS9 suprimido mostró propiedades de replicación casi similares al virus silvestre de la laringotraqueítis en cultivo celular. Los virus negativos a la presencia de gE y gI mostraron una reducción significativa en el tamaño de las placas, mientras que los títulos virales resultaron apenas afectados. Debido a que virus mutantes con deleciones homólogas de genes de otros alfaherpesvirus están en uso como vacunas vivas, los virus de laringotraqueítis recombinantes generados podrían también ser adecuados para esta aplicación.

Marek's disease (MD) is a lymphoproliferative disease of chickens caused by serotype 1 MD virus (MDV). Vaccination of commercial poultry has drastically reduced losses from MD, and the poultry industry cannot be sustained without the use of vaccines. Retrovirus insertion into herpesvirus genomes is an efficient process that alters the biological properties of herpesviruses. RM1, a virus derived from the virulent JM strain of MDV, by insertion of the reticuloendotheliosis (REV) long terminal repeat (LTR), was attenuated for oncogenicity but retains properties of the parental virus, such as lymphoid organ atrophy. Here we show that insertion of the REV LTR into the genome of vaccine strain CVI988 resulted in a virus (CVRM) that replicated to higher levels than parental CVI988 in cell culture and that remained apathogenic for chickens. In addition, CVRM showed protection indices similar or superior to those afforded by CVI988 virus in laboratory and field protection trials, indicating that it could be developed as a safe and efficacious vaccine to protect against very virulent plus MDV.

Nota de Investigación—La inserción de repeticiones terminales largas del virus de la reticuloendoteliosis en el genoma de la cepa CVI988 del virus de Marek resultó en un aumento en el crecimiento y en la protección.

La enfermedad de Marek (MD) es una enfermedad linfoproliferativa de los pollos causada por el serotipo 1 del virus de Marek (MDV). La vacunación de las aves de corral comerciales ha reducido drásticamente las pérdidas por el virus de Marek, y la industria avícola no puede operar sin el uso de vacunas. La inserción de retrovirus en los genomas de los virus del herpes es un proceso eficiente que altera las propiedades biológicas de los herpesvirus. El virus RM1, que es un virus derivado de la cepa virulenta JM mediante la inserción de repeticiones terminales largas del virus de la reticuloendoteliosis (REV) fue atenuado en su oncogenicidad, pero conserva propiedades del virus progenitor, tales como atrofia de los órganos linfoides. En este trabajo se muestra que la inserción de la repetición terminal larga del virus de la reticuloendoteliosis en el genoma de la cepa vacunal CVI988 resultó en un virus (CVRM) que replica en cultivo celular a niveles más altos que los virus progenitores CVI988 y se mantuvo apatógeno para los pollos. Además, el virus CVRM mostró índices de protección similares o superiores a los obtenidos por los virus CVI988 en los ensayos de protección de laboratorio y de campo, lo que indica que podría ser desarrollado como una vacuna segura y eficaz para proteger contra las cepas muy virulentas plus del virus de Marek.

Two glycoproteins of infectious laryngotracheitis virus (ILTV), gI and gB, were expressed in baculovirus and purified for the development of ILTV recombinant protein-based ELISAs. The ability of gB and gI ELISAs to detect ILTV antibodies in chickens vaccinated with viral vector vaccines carrying the ILTV gB gene, Vectormune® FP-LT (the commercial fowlpox vector laryngotracheitis vaccine) and Vectormune® HVT-LT (commercial turkey herpesvirus vector laryngotracheitis vaccine), was evaluated using serum samples from experimentally vaccinated and challenge chickens. The detection of gB antibodies in the absence of gI antibodies in serum from chickens vaccinated with FP-LT indicated that the gB ELISA was specific for the detection of antibodies elicited by vaccination with this viral vector vaccine. The gB ELISA was more sensitive than the commercial ILTV ELISA to detect seroconversion after vaccination with the FP-LT vaccine. Both gI and gB antibodies were detected in the serum samples collected from chickens at different times postchallenge, indicating that the combination of these ELISAs was suitable to screen serum samples from chickens vaccinated with either recombinant viral vector FP-LT or HVT-LT vaccines. The agreement between the gI ELISA and the commercial ELISA to detect antibodies in serum samples collected after challenge was robust. However, further validation of these ELISAs needs to be performed with field samples.

Detección de anticuerpos contra el virus de la laringotraqueítis infecciosa mediante un método de ELISA específico para las glicoproteínas virales en pollos vacunados con vacunas con vectores virales.

Dos glicoproteínas del virus de la laringotraqueitis infecciosa, gI y gB, se expresaron en baculovirus y se purificaron para el desarrollo de un método de ELISA para la laringotraqueítis infecciosa con base en proteínas recombinantes. Se evaluó La capacidad de los métodos de ELISA con las proteínas gB y gI para detectar anticuerpos en pollos inmunizados con vacunas con vectores virales que llevan el gene gB del virus como Vectormune ® FP-LT (Vacuna comercial contra laringotraqueítis con el virus de la viruela aviar como vector) y Vectormune HVT-LT (vacuna comercial con un vector de herpesvirus de pavo contra laringotraqueitis), utilizando muestras de suero de pollos vacunados y desafiados experimentalmente. La detección de anticuerpos contra gB en ausencia de anticuerpos contra gI en el suero de los pollos vacunados con la vacuna FP-LT indicó que el método de ELISA gB era específico para la detección de anticuerpos inducidos por la vacunación con esta vacuna vectorizada. El método de ELISA basado en la proteína gB fue más sensible que el método de ELISA comercial para detectar la seroconversión después de la vacunación con la vacuna FP-LT. Se detectaron anticuerpos contra gI y gB en las muestras de suero recolectadas de pollos después del desafío en momentos diferentes, lo que indica que la combinación de estos métodos ELISA fue adecuada para analizar muestras de suero de los pollos vacunados con cualquiera de las vacunas recombinantes vectorizadas FP-LT o HVT-LT. La concordancia entre el método de ELISA basado en gI y el estuche comercial para detectar anticuerpos en muestras de suero recolectadas después del desafío fue robusta. Sin embargo, se requiere de validación adicional de estos métodos de ELISA con muestras de campo.

To determine the influence of the antibiotics ceftiofur sodium from two different laboratories (A and B) and gentamycin sulfate on a Marek's disease commercial vaccine herpesvirus of turkey (HVT), samples were assayed by titration in chicken embryo fibroblasts (CEF). Viruses were tested in vitro to establish the average number of plaque-forming units before and after different periods of incubation with the addition of the antibiotic. These tests showed no effect of gentamycin or ceftiofur A or B on HVT titers when treatments were for 1 hr or less. However, ceftiofur B decreased the titer at 2 hr. The in vivo effects of the antibiotics were determined by vaccinating 15 one-day-old chickens with HVT plus gentamycin or ceftiofur A or B. Birds were considered viremic at 1 wk postvaccination when one or more plaques were detected in CEF 5 days after inoculation of peripheral blood lymphocytes. Viremia levels were similar between 1 and 16 wk after vaccination with HVT with ceftiofur A or B. The pH values (7.5) were the same in vaccines with and without antibiotics.

Influencia de la adición de antibióticos en la supervivencia del herpesvirus de los pavos.

Para determinar la influencia de los antibióticos ceftiofur sódico elaborado por dos laboratorios diferentes (A y B) y del sulfato de gentamicina en una vacuna comercial contra la enfermedad de Marek que contenía el herpesvirus de los pavos (HVT), las muestras se analizaron por titulación en fibroblastos de embrión de pollo (CEF). Los virus se ensayaron in vitro para determinar el número promedio de unidades formadoras de placas antes y después de diferentes períodos de incubación con la adición de los antibióticos. Estas pruebas no mostraron ningún efecto de la gentamicina o del ceftiofur de los laboratorios A o B sobre los títulos del herpesvirus de los pavos cuando los tratamientos se llevaron a cabo durante una hora o menos. Sin embargo, el ceftiofur del laboratorio B disminuyó el título a las dos horas. Se determinaron los efectos in vivo de los antibióticos mediante la vacunación de pollos de 15 días de edad con el herpesvirus de los pavos más gentamicina o con ceftiofur de ambos laboratorios. Las aves fueron consideradas virémicas a la primera semana después de la vacunación, cuando se detectaron una o más placas en los cultivos de fibroblastos de embrión de pollo a los cinco días después de la inoculación de linfocitos de sangre periférica. Los niveles de viremia fueron similares entre la primera y las 16 semanas después de la vacunación con el herpesvirus de los pavos y con el ceftiofur de los laboratorios A o B. Los valores de pH (7.5) fueron los mismos en las vacunas con o sin antibióticos.

To assess the effect of various vaccine strains on replication and shedding of virulent Marek's disease virus from experimentally infected chickens, quantitative PCR (q-PCR) methods were developed to accurately quantify viral DNA in infected chickens and in the environment in which they were housed. Four groups of 10 chickens, kept in poultry isolators, were vaccinated at 1 day old with one of four vaccines covering each of the three vaccine serotypes, then challenged with very virulent MDV strain Md5 at 8 days of age. At regular time-points, feather tips were collected from each chicken and poultry dust was collected from the air-extract prefilter of each isolator. DNA was extracted from feather and dust samples and subjected to real-time q-PCR, targeting the U_S2 gene of MDV-1, in order to measure Md5 level per 10⁴ feather tip cells or per microgram of dust. Accuracy of DNA extraction from dust and real-time q-PCR were validated by comparing either q-PCR cycle threshold values or the calculated MDV genome level; for use in q-PCR, DNA was extracted from serial dilutions of MDV-infected dust diluted with noninfected dust, or DNA from MDV-infected dust was diluted with DNA from noninfected dust. The results confirmed the accuracy and sensitivity of dust DNA extraction and subsequent q-PCR and showed that differences in virus levels between dust samples truly reflect differences in shedding. Vaccination delayed both replication of Md5 in feather tips and shedding of Md5. First detection of Md5 in feather tips always preceded or coincided with first detection in dust in each group. pCVI988 and HVT SB-1 were the most efficient vaccines in reducing both replication and shedding of Md5. There was close correlation between mean virus level in feathers of each group and mean virus level in the dust shed by that group. This relationship was similar in each of the vaccinated groups, demonstrating that measurement of the virus in dust can be used to monitor accurately both the infection status of the chickens and environmental contamination by MDV.

Relación entre los niveles del virus de Marek muy virulento en el polvo de instalaciones avícolas y en cañones de las plumas en pollos vacunados.

Para evaluar el efecto de diferentes cepas de vacunas sobre la replicación y diseminación del virus muy virulento de la enfermedad de Marek en pollos infectados experimentalmente, se desarrollaron métodos cuantitativos de PCR (q-PCR) para determinar con precisión el ADN viral en los pollos infectados y en el entorno en el que se alojaron. Se alojaron cuatro grupos de 10 pollos por unidad de aislamiento, estas aves fueron vacunadas al primer día de edad con una de cuatro vacunas que incluyen los tres serotipos vacunales. Posteriormente fueron desafiados a los ocho días de edad con la cepa muy virulenta del virus de la enfermedad de Marek, Md5. En intervalos de tiempo regulares, se recolectaron cañones de plumas de cada pollo y también se recolectó el polvo del prefiltro del extractor de cada unidad de aislamiento. Se extrajo el ADN de los cañones de las plumas y de las muestras de polvo y se analizaron por PCR en tiempo real, para el gene U_S2 del virus de Marek 1, con el fin de medir el nivel de virus Md5 por 10⁴ células de plumas o por microgramo de polvo. Se validó la precisión de la extracción de ADN del polvo y el método de PCR en tiempo real mediante la comparación de los ciclos umbrales del método de PCR cuantitativo o por los valores del genoma del virus de Marek. Para su uso en método de PCR cuantitativo, el ADN fue extraído de diluciones seriadas de polvo contaminado con el virus de Marek, diluido con polvo no contaminado, o también, el ADN extraído de polvo contaminado con el virus de Marek se diluyó con ADN de polvo no contaminado. Los resultados confirmaron la precisión y la sensibilidad de la extracción de ADN del polvo y el método de

The Marek's disease virus (MDV) vaccine strain CVI 988 usually is grown in primary chicken embryo fibroblasts (CEFs). We found that the strains could be grown also in the QT35 and JBJ-1 cell lines to titers in the same range as in the CEFs. Both cell lines are fibroblast-like cell lines, which can be grown in flat-bottomed tissue-culture flasks, roller bottles, and on microcarriers. For growth in QT35 cells it was necessary to adapt the virus to the cell line; for growth in JBJ-1 cells this was not necessary. We investigated the efficacy of experimental CVI 988 vaccines grown in QT35 cells and JBJ-1 cells. The efficacy studies were performed in accordance with European Pharmacopoeia (EP) monograph for live MDV disease vaccines. Groups of 1-day-old specific-pathogen-free chicks were vaccinated. Nonvaccinated control groups were included in the studies. Five to 7 days after vaccination all chickens were challenged with the very virulent MDV strain RB1B. After challenge the chickens were observed for a period of 70 days for signs of MD. The protection induced by CVI 988 grown in QT35 cells as well as JBJ-1 cells complied with the requirements of the EP that prescribe that the protection index should be at least 80%. The safety of the vaccines grown in QT35 cells and JBJ-1 cells was tested in a field study in commercial layer chickens. The vaccine virus was not safe after passaging in QT35 cells. This can be explained by the presence of fragments of the genome of MDV strains in the QT35 cell line. No signs of MD were noticed in the study in which CVI988 grown in JBJ-1 cells was tested. It is concluded that the JBJ-1 cell line is a suitable substrate for the current vaccines against MD.

Eficacia y seguridad de los virus vacunales de Marek asociados a células y replicados en cultivos celulares QT35 y JBJ-1.

La cepa vacunal CVI 988 del virus de Marek usualmente se replica en cultivos primarios de embrión de pollo. Se determinó que las cepas también pueden ser replicadas en las líneas celulares QT35 y JBJ-1 produciendo títulos dentro del mismo rango a los que se observan con los cultivos de fibroblastos de embrión de pollo. Ambas líneas celulares son similares a los fibroblastos, que pueden replicarse en botellas de fondo plano, en botellas cilíndricas y en microacarreadores. Para el crecimiento en las células QT35, fue necesario adaptar el virus a esta línea celular. Para el crecimiento en la línea celular JBJ-1 no fue necesaria esta adaptación. Se investigó la eficacia de las vacunas experimentales con la cepa CVI 988 replicadas en las líneas celulares QT35 y JBJ-1. Se realizaron estudios de eficacia de acuerdo con la monografía de la Pharmacopoeia Europea para las vacunas vivas de la enfermedad de Marek. Se vacunaron grupos de pollos libres de patógenos específicos de un día de edad. Se incluyeron controles no vacunados en los estudios. De cinco a siete días después de la vacunación todos los pollos fueron desafiados con la cepa muy virulenta de la enfermedad de Marek RB1B. Después del desafío, los pollos se observaron por un periodo de 70 días para detectar signos de la enfermedad de Marek. La protección inducida por la cepa CVI 988 replicada en células QT35 así como en células JBJ-1 cumplió con los requerimientos de la Pharmacopoeia Europea que prescribe que el índice de protección debe ser de al menos 80%. La seguridad de las vacunas replicadas en la línea celular QT35 y JBJ-1 fue probada en un estudio de campo en aves de postura comerciales. El virus vacunal replicado en la línea celular QT35 no fue seguro después del pasaje. Esto puede explicarse por la presencia de fragmentos del genoma del virus de Marek en la línea celular QT35. No se observaron signos de la enfermedad de Marek en este estudio en donde se probó la cepa CVI988 replicada en células JBJ-1. Se concluye que la línea celular JBJ-1 es un substrato adecuado para las vacunas actuales contra la enfermedad

Probably the most effective current vaccine against Marek's disease is the live Rispens (CVI988) attenuated serotype 1 Marek's disease virus (MDV). It is unknown whether the currently available Rispens vaccines transmit effectively between chickens. To investigate the kinetics and shedding of three commercially available strains of this virus and the extent of lateral transmission, we measured the shedding rate in dander and the viral load in peripheral blood lymphocytes (PBLs) and feather tips over time. Four identical climate-controlled rooms were stocked with a total of 70 specific-pathogen-free chickens for 56 days. In each of three rooms, 10 chickens were vaccinated with one of the commercial vaccines at day old and left in contact with 10 unvaccinated chickens. The fourth room contained 10 unvaccinated control chickens. As determined by MDV-specific quantitative real-time polymerase chain reaction of weekly room dust and individual PBLs and feather tip samples, the vaccine virus was shed from the vaccinated chickens in dander from day 7 postvaccination and transmitted effectively from vaccinated to in-contact chickens with a lag period of 2–3 wk. Viral load in PBLs and feather tips peaked at days 7 and 14, respectively, and declined thereafter, whereas viral load in dust increased rapidly to day 21 and then increased gradually thereafter. Antibody titer at day 56 was correlated with earlier measures of MDV load in PBLs but not feather tips or dust. These results show that currently available Rispens CVI988 vaccine virus is shed in significant quantities from vaccinated chickens and transmits effectively between chickens.

Cinética viral, perfil de eliminación y transmisión de la vacuna contra la enfermedad de Marek serotipo 1 Rispens/CVI988 en pollos libres de anticuerpos maternos.

Probablemente, la vacuna actual más eficaz contra la enfermedad de Marek es la vacuna viva atenuada del serotipo 1 Rispens (CVI988). Actualmente, no se sabe si las vacunas disponibles se transmiten eficazmente entre los pollos. Para investigar la cinética y eliminación de tres cepas comercialmente disponibles de este virus y el grado de transmisión lateral, se determinaron la tasa de eliminación en la caspa y la carga viral en los linfocitos de la sangre periférica y en los cálamos de las plumas, a lo largo de diferentes puntos en el tiempo. Cuatro cuartos idénticos con clima controlado fueron abastecidos con un total de 70 pollos libres de patógenos específicos por 56 días. En cada una de las tres habitaciones, 10 pollos fueron vacunados con una de las vacunas comerciales al primer día de edad y se mantuvieron en contacto con 10 aves no vacunadas. La cuarta sala contenía 10 pollos controles no vacunados. Mediante una prueba de PCR en tiempo real cuantitativa y específica para el virus de Marek y analizando semanalmente muestras del polvo de los cuartos, de muestras individuales de linfocitos periféricos y de cálamos de la pluma, se determinó que el virus vacunal fue eliminado de los pollos vacunados a través de la caspa desde los 7 días después de la vacunación y que se transmitía con eficacia de los pollos vacunados a los pollos contactos susceptibles con un periodo de eclipse de dos a tres semanas. La carga viral en los linfocitos periféricos y en los cálamos de la pluma alcanzó un máximo a los siete y catorce días, respectivamente, y disminuyó a partir de entonces, mientras que la carga viral en polvo se incrementó rápidamente a los 21 días y luego aumentó gradualmente a partir de ese momento. El título de anticuerpos en el día 56 se correlacionó con mediciones anteriores de la carga viral del virus de Marek en linfocitos periféricos pero no en los cálamos de la pluma o en el polvo. Estos resultados muestran que el virus vacunal actualmente disponible Rispens CVI988 se elimina en cantidades significativas de pollos vacunados y se transmite eficazmente a pollos susceptibles.

Marek's disease virus (MDV), a highly cell-associated lymphotropic alphaherpesvirus, is the causative agent of a neoplastic disease in domestic chickens called Marek's disease (MD). In the unique long (UL) region of the MDV genome, open reading frames UL39 and UL40 encode the large and small subunits of the ribonucleotide reductase (RR) enzyme, named RR1 and RR2, respectively. MDV RR is distinguishable from that present in chicken and duck cells by monoclonal antibody T81. Using recombinant DNA technology we have generated a mutant MDV (Md5ΔRR1) in which RR1 was deleted. PCR amplification of the RR gene in Md5ΔRR1-infected duck embryo fibroblasts (DEF) confirmed the deletion of the 2.4 kb RR1 gene with a resultant amplicon of a 640-bp fragment. Restriction enzyme digests with SalI confirmed a UL39 deletion and the absence of gross rearrangement. The biologic characteristics of Md5ΔRR1 virus were studied in vitro and in vivo. The Md5ΔRR1 replicated in DEF, but significantly slower than parental Md5-BAC, suggesting that RR is important but not essential for replication in fibroblasts. In vivo studies, however, showed that the RR1 deletion virus was impaired for its ability to replicate in chickens. Inoculation of specific-pathogen-free (SPF) chickens with Md5ΔRR1 showed the mutant virus is nonpathogenic and does not induce MD in birds. A revertant virus, Md5ΔRR1/R, was generated with the restored phenotype of the parental Md5-BAC in vivo, indicating that RR is essential for replication of the virus in chickens. Protection studies in SPF chickens indicated that the Md5ΔRR1 virus is not a candidate vaccine against MD.

La deleción de la subunidad mayor de la ribonucleótido reductasa (RR) del virus de la enfermedad de Marek afecta el crecimiento del virus in vitro e in vivo.

El virus de la enfermedad de Marek (MDV), un alfaherpesvirus linfotrópico altamente asociado a células, es el agente causal de una enfermedad neoplásica en pollos domésticos llamada enfermedad de Marek (MD). En la región única larga (UL) del genoma del virus de Marek, los marcos de lectura contínuos UL39 y UL40 codifican las subunidades mayor y menor de la enzima ribonucleótido reductasa (RR), denominadas RR1 y RR2, respectivamente. La enzima ribonucleótido reductasa del virus de Marek es distinguible de la presente a partir en las células de pollo y pato mediante el anticuerpo monoclonal T81. Con el uso de tecnología de ADN recombinante se ha generado un virus de Marek (Md5ΔRR1) en el cual la subunidad RR1 ha sido eliminada. La amplificación mediante PCR del gene RR en fibroblastos de embrión de pato (DEF) infectados por el virus Md5ΔRR1, confirmó la deleción de la subunidad RR1 de 2.4 kb con un amplicón resultante de un fragmento de 640 pb. La digestión con la enzima de restricción SalI confirmó una deleción del UL39 y una ausencia de reordenamiento. Las características biológicas del virus Md5ΔRR1 se estudiaron in vitro e in vivo. El virus Md5ΔRR1 se replicó en fibroblastos de embrión de pato, pero su replicación fue significativamente más lenta que la del virus progenitor Md5-BAC, lo que sugiere que la enzima ribonucleótido reductasa es importante pero no esencial para la replicación en los fibroblastos. Sin embargo en estudios in vivo, se demostró que el virus con deleción de la subunidad RR1 resultó afectado en su capacidad para replicarse en pollos. La inoculación de pollos libres de patógenos específicos (SPF) con el virus Md5ΔRR1 mostraron que el virus mutante no es patógeno y no induce la enfermedad de Marek en las aves. Un virus revertiente, Md5ΔRR1 / R, se generó con el fenotipo restaurado del virus progenitor Md5-BAC in vivo, lo que indica que la ribonucleótido reductasa es esencial para la replicación del virus en los pollos. Es

Bacterial artificial chromosome (BAC) vectors were first developed to facilitate propagation and manipulation of large DNA fragments. This technology was later used to clone full-length genomes of large DNA viruses to study viral gene function. Marek's disease virus (MDV) is a highly oncogenic herpesvirus that causes rapid induction of T-cell lymphomas in chickens. Based on the virus's ability to cause disease in vaccinated chickens, MDV strains are classified into pathotypes, with the most virulent strains belonging to the very virulent plus (vv ) pathotype. Here we report the construction of BAC clones of 686 (686-BAC), a vv strain of MDV. Transfection of DNA isolated from two independent clones into duck embryo fibroblasts resulted in recovery of infectious virus. Pathogenesis studies showed that the BAC-derived 686 viruses were more virulent than Md5, a vv strain of MDV. With the use of a two-step red-mediated mutagenesis process, both copies of viral interleukin 8 (vIL-8) were deleted from the MDV genome, showing that 686-BACs were amenable to mutagenesis techniques. The generation of BAC clones from a vv strain of MDV is a significant step toward understanding molecular basis of MDV pathogenesis.

Nota de Investigación—Clonación de un virus muy virulento plus de la enfermedad de Marek, cepa 686 mediante un cromosoma bacteriano artificial.

Los vectores basados en cromosomas bacterianos artificiales (BAC) fueron desarrollados inicialmente para facilitar la propagación y manipulación de grandes fragmentos de ADN. Esta tecnología se utilizó posteriormente para clonar en su totalidad genomas de virus con ADN muy largos; para estudiar la función de genes virales. El virus de la enfermedad de Marek (MDV) es un herpesvirus altamente oncogénico que causa una rápida inducción de linfomas de células T en pollos. De acuerdo con la capacidad del virus para causar la enfermedad en los pollos vacunados, las cepas del virus de Marek se clasifican en patotipos, siendo las cepas más virulentas, las que están incluidas en el patotipo de cepas muy virulentas plus (vv ). En este trabajo, se presenta la construcción de clones de la cepa 686, que es una cepa vv , en cromosomas bacterianos artificiales (686-BAC). La transfección de ADN aislado a partir de dos clones independientes en fibroblastos de embrión de pato dio como resultado la recuperación de virus infeccioso. Los estudios de patogénesis mostraron que los virus derivados del clon 686-BAC virus fueron más virulentos que la cepa Md5, que es un virus muy virulento (vv). Mediante un proceso de mutagénesis con dos pasos, las dos copias de interleucina viral 8 (vIL-8) se eliminaron del genoma del virus de Marek, lo que muestra que los virus derivados del 686-BAC eran adecuados para realizar técnicas de mutagénesis. La generación de clones con cromosomas bacterianos artificiales de una cepa del virus de Marek muy virulenta plus es un paso importante hacia la comprensión de las bases moleculares de la patogénesis del virus de Marek.

Since the first report of a polyneuritis in chickens by Joseph Marek in 1907, the clinical nature of the disease has changed. Over the last five decades, the pathogenicity of the Marek's disease virus (MDV) has continued to evolve from the relatively mild strains observed in the 1960s to the more severe strains labeled very virulent plus currently observed in today's outbreaks. To understand the influence of host genetics, specifically the major histocompatibility complex (MHC), on virus evolution, a bacterial artificial chromosome–derived MDV (Md5B40BAC) was passed in vivo through resistant (MHC-B21) and susceptible (MHC-B13) Line 0 chickens. Criteria for selecting virus isolates for in vivo passage were based on virus replication in white blood cells 21 days after challenge and evaluation of MD pathology at necropsy. In the MHC-B13–susceptible line the Md5B40BAC virulence consistently increased from 18% Marek's disease (MD) after in vivo passage 1 (B13-IVP1 Md5B40BAC) to 94% MD after B13-IVP5 Md5B40BAC challenge. In the MHC-B21–resistant line MD virulence fluctuated from 28% at B21-IVP1 Md5B40BAC to a high of 65% in B21-IVP2 Md5B40BAC back to a low of 23% in B21-IVP5 Md5B40BAC–challenged chicks. Although the B21-IVP5 Md5B40BAC isolates were relatively mild in the MHC-B21 chicken line (56% MDV), they were highly virulent in the MHC-B13 line (100% MDV). From this series of experiments it would appear that MDV evolution toward greater virulence occurs in both susceptible and resistant MHC haplotypes, but the resulting increase in pathogenicity is constrained by the resistant MHC haplotype.

Influencia de la genética del hospedero en la evolución del virus de la enfermedad de Marek.

Desde el primer reporte de polineuritis en pollos por Joseph Marek en 1907, la naturaleza clínica de la enfermedad ha cambiado. En las últimas cinco décadas, la patogenicidad del virus de Marek ha continuado su evolución de cepas relativamente leves observadas en los años 1960 a las cepas más severas identificadas como cepas muy virulentas plus, que actualmente se observan en los brotes actuales. Para entender la influencia de la genética del hospedero, específicamente el complejo mayor de histocompatibilidad en la evolución del virus, un virus de la enfermedad de Marek derivado de un cromosoma bacteriano artificial (Md5B40BAC) fue propagado in vivo a través de una línea 0 de pollos resistente (MHC-B21) y una susceptible (MHC-B13). El criterio para seleccionar los aislamientos virales para el aislamiento in vivo se basó en la replicación en leucocitos 21 días después del desafío y evaluación de la patología por el virus de Marek a la necropsia. En la línea susceptible MHC-B13, la virulencia del virus Md5B40BAC se incrementó de 18% de la enfermedad de Marek hasta después del pasaje in vivo número 1 (B13-IVP1 Md5B40BAC) hasta 94% en la enfermedad de Marek después del desafío con el virus B13-IVP5 Md5B40BAC. En la línea resistente a la enfermedad de Marek MHC-B21, la virulencia fluctuó de 28% con el virus B21-IVP1 Md5B40BAC hasta 65% con el virus B21-IVP2 Md5B40BAC y de regreso a un nivel tan bajo como 23% en los pollos desafiados con el virus B21-IVP5 Md5B40BAC. Aunque los aislamientos B21-IVP5 Md5B40BAC fueron relativamente leves en la línea de pollos MHC-B21 (56% con la enfermedad de Marek), ellos fueron muy virulentos con la línea de pollos MHC-B13 (100% con la enfermedad de Marek). De esta serie de experimentos parece que la evolución del virus de Marek hacia una virulencia mayor ocurre tanto con haplotipos susceptibles y resistentes del complejo mayor de histocompatibilidad, pero el incremento resultante es restringido por el haplotipo resistente del complejo mayor de histocompatibilidad.

A questionnaire was widely distributed in 2011 to estimate the global prevalence of Marek's disease (MD) and gain a better understanding of current control strategies and future concerns. A total of 112 questionnaires were returned representing 116 countries from sources including national branch secretaries of the World Veterinary Poultry Association, vaccine, breeder, and production companies, as well as MD researchers from various backgrounds. Each country listed on a questionnaire was recorded as an individual entry, and on average there were 2.0 entries per country (median 1; range 1–13). All flock types were listed as having increased MD incidence during the last 10 yr in close to 50% of countries by at least one respondent, with the majority of these countries located within French-speaking Africa, Eastern Europe, East Asia, and South America. Only 18 countries (16%) indicated increasing MD incidence was likely due to higher virulent strains, while the presence of other immunosuppressive diseases was a more common explanation. Increased use of CVI988/Rispens was cited as the most likely reason for decreasing MD incidence in 49 countries (42%). In the United States, MD incidence has continued to decrease during the last 10 yr, reaching a record low in 2007 (0.0008%) as measured by leukosis condemnation rates in broilers at slaughter. However, a recent increase of leukosis condemnations in North Carolina and Pennsylvania needs to be closely monitored.

Nota de Investigación—Estado actual de la enfermedad de Marek en los Estados Unidos y en el mundo basado en una encuesta.

Se distribuyó ampliamente un cuestionario en el año 2011 para estimar la prevalencia mundial de la enfermedad de Marek (MD) y para obtener una mejor comprensión de las estrategias de control actuales y de las preocupaciones futuras. Un total de 112 cuestionarios fueron devueltos representando 116 países. Las fuentes incluyeron secretarios de las representaciones en los diferentes países de la Asociación Veterinaria Avícola Mundial, también se incluyeron compañías de vacunas, de reproductoras y de producción, así como investigadores dedicados a la enfermedad de Marek con diversas especialidades. Cada país que aparece en el cuestionario se registró como una entrada individual, y en promedio se obtuvieron 2.0 entradas por cada país (mediana de 1, rango de uno a 13). Todos los tipos de parvadas fueron listadas con un aumento en la incidencia de la enfermedad de Marek durante los últimos 10 años en casi el 50% de los países por lo menos en una de las fuentes encuestadas, la mayoría de estos países se encontraron en el África francófona, Europa del Este, en el este de Asia y en América del Sur. Sólo 18 países (16%) indicaron que el aumento en la incidencia de la enfermedad de Marek probablemente se debió al aumento de cepas virulentas, mientras que la presencia de otras enfermedades inmunosupresoras fue la explicación más común. El uso mayor de la cepa CVI988/Rispens fue citada como la razón más probable de la disminución de la incidencia de la enfermedad de Marek en 49 países (42%). En los Estados Unidos, la incidencia de la enfermedad de Marek ha seguido disminuyendo durante los últimos 10 años, alcanzando un mínimo histórico en año 2007 (0.0008%), medida por las tasas de decomisos por tumores (decomisos clasificados genéricamente con el término: leucosis) en pollos de engorde en la planta de procesamiento. Sin embargo, un reciente aumento de los decomisos por leucosis en Carolina del Norte y Pennsylvania necesita ser estudiado de manera más profunda.

We have previously shown that deletion of the meq gene from the genome of Cosmid-cloned rMd5 strain of Marek's disease virus (MDV-1) resulted in loss of transformation and oncogenic capacity of the virus. The rMd5ΔMeq (Meq null) virus has been shown to be an excellent vaccine in maternal antibody positive (MAb ) chickens challenged with a very virulent plus (vv ) strain of MDV, 648A. The only drawback was that it retained its ability to induce bursa and thymus atrophy (BTA) like that of the parental rMd5 in maternal antibody negative (MAb−) chickens. We recently reported that the attenuated Meq null virus did not induce BTA at the 40th cell culture passage onward. Its protective ability against challenge with vv MDV, strain 686 was similar to the original virus at the 19th passage in MAb− chickens. In this study, we compared the same series of attenuated meq null viruses in commercial chickens. In commercial chickens with MAb, the attenuated viruses quickly lost protection with increasing cell culture attenuation. These data suggest that although attenuation of these meq null viruses eliminated BTA, it had no influence on their protective efficacy in MAb− chickens. However, in commercial chickens (MAb ), the best protection was provided by the original 19th passage; the attenuated 40th passage was as good as one of the currently commercial CVI988/Rispens vaccine, and it did not induce BTA. Therefore, protection against virulent MDV challenge and induction of lymphoid organ atrophy are simultaneously attenuated by serial passage in vitro.

Propiedades de la vacuna rMd5 con deleción del gene meq: contra la enfermedad de Marek: La protección contra el desafío virulento y la inducción de la atrofia de órganos linfoides son simultáneamente atenuadas por pasajes seriados in vitro.

Se ha demostrado previamente que la supresión del gene meq del genoma de la cepa rMd5 del virus de la enfermedad de Marek serotipo 1 (MDV-1) clonada en cósmidos resultó en la pérdida de la capacidad de transformación y oncogénica del virus. El virus rMd5ΔMeq (con el gene Meq nulificado) ha demostrado ser una excelente vacuna en pollos con anticuerpos maternos (MAb ) y desafiados con una cepa muy virulenta plus (vv ), la cepa 648A. El único inconveniente era que conservaba su capacidad de inducir atrofia del timo y de la bolsa de Fabricio como la observada con la cepa rMd5 original en pollos sin anticuerpos maternos (MAB-). Recientemente, se reportó que el virus atenuado con el producto Meq nulo, no indujo atrofia del timo ni de la bolsa a partir del pasaje 40 en cultivos celulares. Su capacidad de protección contra el desafío con un virus de Marek muy virulento plus, cepa 686 era similar al virus original en el paso 19a en pollos sin anticuerpos maternales. En este estudio, se comparó la misma serie de virus atenuados con el gene meq nulificado en pollos comerciales. En los pollos comerciales con anticuerpos maternales, los virus atenuados perdieron rápidamente su capacidad de protección con el pasaje de atenuación consecutivo en cultivo celular. Estos datos sugieren que aunque la atenuación de estos virus con el gene meq nulificado eliminó la capacidad de inducir atrofia del timo y de la bolsa, no tenía ninguna influencia sobre su eficacia protectora en pollos sin anticuerpos maternos. Sin embargo, en pollos comerciales (con anticuerpos maternos), la mejor protección fue proporcionada por el pasaje original 19; el pasaje atenuado 40 fue tan bueno como la vacuna comercial actual CVI988/Rispens y no indujo atrofia del timo ni de la bolsa de Fabricio. Por lo tanto, la protección contra el desafío virulento de la enfermedad de Marek y la inducc

A possible interference after Marek's disease (MD) vaccination using an experimental bivalent vaccine, consisting of a redesigned CVI-988/Rispens-type MDV-1 strain and herpesvirus of turkeys, with vaccination against infectious bronchitis (IB) virus (IBV) or Newcastle disease (ND) virus (NDV) was examined. Day-old specific-pathogen-free chicks were concomitantly vaccinated with the bivalent MD vaccine (either intramuscularly or subcutaneously) and with commercially available vaccines against ND or IB. Afterward chickens were challenged with either lethal MD virus (MDV) or NDV strains or with a pathogenic IBV strain. After challenge, neither mortality nor notable clinical signs of MD, ND, or IB were observed in the vaccinated birds. The experimental bivalent MDV vaccine proved efficacious against lethal MDV challenge and did not affect the efficacy of the NDV or IBV vaccines. In conclusion, no signs of interference or adverse effects were detected. Thus, the vaccines can be administered concomitantly on chickens' first day of life.

La aplicación de una vacuna bivalente contra la enfermedad de Marek no interfiere con las vacunas contra la bronquitis infecciosa o enfermedad de Newcastle y demuestra ser eficaz.

Se estudió un posible efecto de interferencia posterior a la vacunación contra la enfermedad de Marek (MD) con una vacuna bivalente experimental, que consiste en una nueva cepa de Marek 1 tipo Rispens CVI988 y el herpesvirus de pavos, sobre la vacunación contra el virus de la bronquitis infecciosa o contra el virus de la enfermedad de Newcastle. Se vacunaron de manera simultánea pollos libres de patógenos específicos de un día de edad con la vacuna bivalente de Marek (vía intramuscular o subcutánea) y con las vacunas comercialmente disponibles contra la enfermedad de Newcastle y bronquitis infecciosa. Posteriormente, los pollos fueron desafiados ya sea con una cepa letal del virus de Marek o de Newcastle o con una cepa patógena del virus de la bronquitis infecciosa. Después del desafío, no hubo mortalidad ni se observaron signos clínicos evidentes de la enfermedad de Marek, Newcastle o de bronquitis infecciosa en las aves vacunadas. Se demostró que la vacuna experimental bivalente de Marek fue eficaz contra el desafío con una cepa letal del mismo virus y no afectó a la eficacia de las vacunas de Newcastle o de bronquitis. En conclusión, no se detectaron signos de interferencia o efectos adversos. Por lo tanto, las vacunas se pueden administrar de forma simultánea en pollos de un día de edad.

The role of pp38 in the pathogenesis of Marek's disease (MD) has not been fully elucidated. Previously, we reported the presence of two splice variants (Spl A and Spl B) for pp38. We also reported that the wild-type pp38 (WT), as well as the mutated pp38 (MUT), altered the oxidative phosphorylation pathway in infected cells. To determine whether the different forms of pp38 are important for the pathogenesis of MD, we generated RB-1B–based bacterial artificial chromosome (BAC) clones expressing pp38MUT, pp38Spl A, and pp38Spl B. Infectious viruses were recovered from these BAC clones in chick kidney cells (CKC). The Spl A and Spl B viruses had significantly smaller plaque sizes and replicated to a lesser degree in CKC than the WT and MUT viruses. Two in vivo experiments were conducted by inoculating 7-day-old P2a chicks with 1000 plaque-forming units of each virus. In the first experiment, chicks were sacrificed at 4, 8, 11, and 15 days postinfection (PI). WT and MUT viruses had similar viremia levels using virus isolation and quantitative real-time PCR (qPCR) assays, whereas Spl A and Spl B viruses had significantly lower viremia levels than WT and MUT viruses. In the second experiment, we showed that tumor development and MD mortality were similar in the WT- and MUT-infected chickens, with all birds MD positive at 5 wk PI. In contrast, chickens infected with Spl B and Spl A had a significantly lower MD incidence at 11 wk PI, when the experiment was terminated.

Importancia de la expresión diferencial del gene pp38 del virus de Marek en la patogénesis de la enfermedad de Marek.

El papel del gene pp38 en la patogénesis de la enfermedad de Marek (con las siglas en inglés MD) no ha sido aclarado completamente. Previamente se reportó acerca de la presencia de dos variantes alternativas de corte y empalme (Spl A y Spl B) para el gene pp38. También se informó de que el gene pp38 de tipo silvestre (WT), así como la forma mutante de pp38 (MUT), alteraron la vía de la fosforilación oxidativa en las células infectadas. Para determinar si las diferentes formas del gene pp38 son importantes para la patogénesis de la enfermedad de Marek, se generaron clones del virus RB-1B mediantes clonación en un cromosoma bacteriano artificial (BAC) que expresaban a los virus infecciosos pp38MUT, pp38Spl A y pp38Spl B. Se recuperaron partículas infecciosas a partir de estos clones BAC en cultivos de células renales de pollo (CKC). Los virus Spl A y Spl B producían placas significativamente más pequeñas y se replicaban en un grado menor en los cultivos de células renales en comparación con el virus silvestre y su forma mutante. Se llevaron a cabo dos experimentos in vivo mediante la inoculación de pollos P2a de siete días de edad con 1000 unidades formadoras de placa de cada virus. En el primer experimento, los pollos fueron sacrificados a los 4, 8, 11, y 15 días después de la infección. Los virus silvestre y mutante produjeron niveles similares de viremia que se determinaron mediante el aislamiento del virus y ensayos de PCR cuantitativos en tiempo real, mientras que los virus Spl A y Spl B mostraron niveles significativamente más bajos de viremia en comparación con los virus silvestre y mutante. En el segundo experimento, se demostró que el desarrollo de tumores y la mortalidad por la enfermedad de Marek fue similar en los pollos infectados con los virus silvestre o mutante, con todas las aves positivas a la enfermedad de Marek a las 5 semanas después de la inoculación. En contraste, los pollos infectados con los virus Spl B y Spl A mostraron una incidencia de la enfermedad de Marek significativamente menor a las once semanas después de la inoculación, cuando se concluyó el experimento.

Marek's disease (MD) is a highly transmissible, herpesvirus-associated malignancy of chickens and turkeys caused by Marek's disease virus (MDV). MD is currently controlled through the use of nonsterilizing vaccines composed of antigenically related, apathogenic herpesviruses Mardivirus 2 (MDV-2), Meleagrid herpesvirus 1 (herpesvirus of turkeys, HVT), or attenuated MDV-1 strain CVI988 (Rispens). Since the mid-1960s, field strains of MDV have increased in virulence, due, in part, to the widespread use of vaccines since the early 1970s. One mutation that we have identified common to very virulent field strains (vv and vv MDVs) since the 1990s has been a mutation in the UL1 gene, encoding glycoprotein L (gL). This mutation, a 12-nucleotide (nt) deletion in the signal peptide of gL, has been associated with increased virulence and decreased vaccine protection in the context of challenge with a vv MDV, strain TK. To determine whether this mutation alone was sufficient to confer increased virulence, we introduced this mutation into the transmission-competent pRB-1B bacterial artificial chromosome (BAC) using two-step, Red-mediated recombination. The resulting mutant, pRB-1BgLΔ, was tested for changes in replication in cell culture using multistep growth curves, plaque size analysis, viral burst analysis, and the ability to compete with the parental virus when co-transfected at different ratios and sequentially passaged. In addition, we examined this mutant for changes in pathogenicity in inoculated and contact-exposed unvaccinated and vaccinated chickens. Our data show minor differences in plaque sizes in cell culture, but no discernible changes in the infection of specific-pathogen-free (SPF) leghorn chickens. We therefore conclude that although this mutation is indeed common to MDV field strains isolated in the eastern United States, it is insufficient to confer increased virulence or loss of vaccine protection previously observed for a vv MDV strain having this mutation.

Una deleción en el gene de la glicoproteína L de cepas de campo del virus de la enfermedad de Marek en los Estados Unidos es insuficiente para conferir mayor patogenicidad a un cromosoma bacteriano artificial basado en la cepa, RB-1B.

La enfermedad de Marek (MD) es una enfermedad tumoral de pollos y pavos que es altamente transmisible asociada a un herpesvirus y es causada por el virus de la enfermedad de Marek (MDV). La enfermedad de Marek está actualmente controlada a través del uso de las vacunas compuestas de herpesvirus no patógenos relacionados antigénicamente, Mardivirus 2 (MDV-2) y Meleagrid herpesvirus 1 (herpesvirus de los pavos, HVT), o con la cepa atenuada CVI988 (Rispens). Desde mediados de la década de los 1960s, las cepas de campo del virus de Marek han aumentado su virulencia, debido en parte al uso generalizado de vacunas desde principios de los años 1970s. Se ha identificado una mutación común con las cepas de campo altamente virulentas (vv y vv MDV) desde la década de los 1990s, ha sido una mutación en el gen UL1, que codifica la glicoproteína L (gL). Esta mutación, que es una deleción de 12 nucleótidos (nt) en el péptido señal de la glicoproteína L, se ha asociado con aumento en la virulencia y con la disminución de la protección de vacuna ante un desafío con la cepa muy virulenta plus, cepa TK. Para determinar si esta mutación por sí sola era suficiente para conferir mayor virulencia, se introdujo esta mutación en un cromosoma bacteriano artificial (BAC) denominado pRB-1B que es competente en su transmisión, utilizando una recombinación mediada por Red de dos pasos. Se analizó el mutante resultante, pRB-1BgLΔ, para determinar los cambios en la replicación en cultivo celular mediante curvas de crecimiento de pasos múltiples, análisis del tamaño de las placas, análisis de estallido viral, y la capacidad para competir con el virus progenitor cuando se co-transfectaron en diferentes pr

A challenge test following inoculation with a standard amount of a vv strain of the Marek's disease (MD) virus in multiple lines and multiple generations of egg type chicken and the corresponding phenotypic trend are described. This program significantly reduced mortality of progeny from selected sires for three to 11 generations in eight of the nine elite lines studied herein. In brown egg lines, a retrospective analysis of DNA indicated an association between the blood type B (major histocompatibility complex) of the sire and the MD mortality in the challenge of its progeny. As a result of the multigeneration stock amplification and crossbreeding processes used in the commercial breeding industry, improvement in survival after challenge at the elite level will translate to improved welfare for millions of birds at the commercial production level.

Mejoramiento de los resultados de desafío contra la enfermedad de Marek en múltiples líneas de aves productoras de huevo.

Se describe un programa de desafío viral mediante la inoculación de una cantidad estándar del virus de la enfermedad de Marek muy virulento plus (con las siglas en inglés: MDV) en múltiples líneas y en múltiples generaciones de aves de postura, y se describe también la tendencia fenotípica correspondiente. Este programa redujo significativamente la mortalidad en la progenie de gallos seleccionados entre tres y once generaciones, en ocho de las nueve líneas elite estudiadas en esta investigación. En las líneas de huevo marrón, un análisis retrospectivo de ADN indicó la existencia de una asociación entre el tipo de grupo sanguíneo B (complejo mayor de histocompatibilidad) del gallo y la mortalidad por la enfermedad de Marek en la progenie. Como resultado de un proceso de amplificación en múltiples generaciones y del uso de cruzamiento de diversas líneas, utilizadas en la industria avícola, una mejora de la sobrevivencia después del desafío viral a nivel de líneas élite se traducirá en un mayor bienestar para millones de aves a nivel de producción comercial.

Conventional live attenuated vaccines have been used as the main tool worldwide for the control of infectious laryngotracheitis. However, their suboptimal attenuation combined with poor mass administration practices allowed chicken embryo origin vaccine-derived isolates to circulate in the field, regain virulence, and be the cause of continuous outbreaks of the disease. Previous studies indicated that stable attenuation of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) can be achieved by the deletion of individual viral genes that are not essential for viral replication in vitro. One of these genes is the glycoprotein J (gJ) gene. Its deletion provided significant attenuation to virulent ILTV strains from Europe and the United States. The objective of this study was to construct an attenuated gJ-deleted ILTV strain and evaluate its safety and efficacy for in ovo (IO) administration of commercial broilers. A novel gJ-deleted virus (NΔgJ) was constructed, and a 10³ median tissue culture infective dose administered at 18 days of embryo age was considered safe because it did not affect hatchability or survivability of chickens during the first week posthatch. Broilers vaccinated IO and IO eye drop at 14 days of age presented a significant reduction in clinical signs and reduction of virus loads after challenge, as compared with the nonvaccinated challenged group of chickens. Therefore, this study presents initial proof that the NΔgJ strain is a potential ILTV live-attenuated vaccine candidate suitable for IO vaccination of commercial broilers.

Vacunación in ovo de pollos de engorde comerciales con una cepa del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar que presenta deleción del gene de la glicoproteína J.

Las vacunas vivas atenuadas convencionales han sido utilizadas como la herramienta principal en todo el mundo para el control de la laringotraqueítis infecciosa. Sin embargo, su atenuación subóptima combinada con malas prácticas de administración masiva permitió que derivados de la vacuna con origen en embrión de pollo circularan en el campo, que recuperaran su virulencia, y que fueran la causa de los brotes continuos de la enfermedad. Estudios anteriores indicaron que la atenuación estable del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV) se puede lograr mediante la eliminación de cada uno de los genes virales que no son esenciales para la replicación viral in vitro. Uno de estos genes, es el de la glicoproteína J (gJ). Su supresión ha ofrecido una atenuación significativa de cepas virulentas del virus de laringotraqueítis de Europa y de los Estados Unidos. El objetivo de este estudio fue construir una vacuna atenuada con supresión del gene gJ y evaluar su seguridad y eficacia para una administración in ovo (IO) en pollos de engorde comerciales. Se construyó un virus nuevo con el gene gJ eliminado (NΔgJ) y se consideró que una dosis media de 10³ dosis infectantes para cultivos de tejidos administrada a los 18 días de desarrollo embrionario fue segura debido a que no afectó la incubabilidad o la supervivencia de los pollos durante la primera semana después de la eclosión. Los pollos vacunados in ovo o vacunados in ovo y con una vacunación ocular a los 14 días de edad, mostraron una reducción significativa de los signos clínicos y una reducción de las cargas virales en la tráquea y en la conjuntiva después del desafío en comparación con el grupo de pollos no vacunados y que fueron desafiados. Por lo tanto, este estudio presenta una prueba inicial de que la cepa NΔgJ es un candidato potencial de una vacuna viva atenuada contra la laringotraqueítis que es adecuada para la vacunación in ovo de pollos de engorde.

The worldwide distribution of chicken anemia virus (CAV) and Marek's disease virus (MDV) is well documented. In addition to their economic significance in single- or dual-virus infections, the two viruses can often accompany various other pathogens and affect poultry health either directly, by causing tumors, anemia, and delayed growth, or indirectly, by aggravating other diseases, as a result of their immunosuppressive effects. After a decade of employing the molecular diagnosis of those viruses, which replaced conventional virus isolation, we present the development of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of both viruses. The real-time PCRs for MDV and for CAV alone are more sensitive than the respective end-point PCRs. In addition, the multiplex real-time shows a similar sensitivity when compared to the single real-time PCR for each virus. The newly developed real-time multiplex PCR is of importance in terms of the diagnosis and detection of low copies of each virus, MDV and CAV in single- and in multiple-virus infections, and its applicability will be further evaluated.

Cuantificación del virus de la enfermedad de Marek y del virus de la anemia infecciosa en los órganos de pollos infectados experimentalmente y de pollos comerciales mediante una prueba de PCR múltiple en tiempo real.

La distribución mundial del virus de la anemia infecciosa del pollo (CAV) y del virus de la enfermedad de Marek (MDV) está bien documentada. Además de su importancia económica en infecciones simples o por los dos virus. Estos dos agentes a menudo pueden acompañar otros patógenos diversos y afectan a la salud de las aves de corral, ya sea directamente, por los tumores que causan, por la anemia o por retraso en el crecimiento, o indirectamente, al aumentar la severidad de otras enfermedades, como consecuencia de sus efectos inmunosupresores. Después de una década de emplear el diagnóstico molecular, que sustituyó el aislamiento viral convencional, se presenta el desarrollo de un método de PCR múltiple en tiempo real para la detección simultánea de ambos virus. Los métodos de PCR en tiempo real para el virus de Marek y para el virus de la anemia por separado son más sensibles que los respectivos métodos de PCR de punto final. Además, el procedimiento de PCR múltiple en tiempo real muestra una sensibilidad similar en comparación con los métodos de PCR en tiempo real por separado para cada virus. El método de PCR múltiple en tiempo real recién desarrollado es de importancia en términos de diagnóstico y para la detección de bajos niveles de copias para cada virus, para diagnosticar infecciones simples o múltiples y su aplicabilidad se seguirá evaluando.

The previously conducted study on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has shown its usefulness for the detection of Marek's disease virus (MDV) virulent field strains. The current study improves the previously designed LAMP method with an additional pair of loop primers, which accelerates the reaction, and describes two other LAMP procedures for the specific detection of FC126 strain of turkey herpesvirus and nonpathogenic SB-1 strain. The developed LAMP procedures were also confirmed and compared with PCR. Each LAMP reaction used three pairs of specific primers designed to target the nucleotide sequence of the very virulent MDV strain, the SB-1 strain of MDV-2, and turkey herpesvirus, respectively. All LAMP reactions were flexible and provided reliable results at a wide range of incubation temperatures from 54.0 to 62.3 C in 15 to 90 min. LAMP does not need any thermocyclers, because all assays were conducted in a water bath. The green fluorescence signal was recorded under ultraviolet illumination in LAMP samples containing virulent MDV and turkey herpesvirus where SYBR Green was added to the reaction mixture, whereas the SB-1–positive samples presented orange illumination after GelRed™ staining solution. The sensitivity of the three LAMP reactions ranged from 2 log₁₀ plaque-forming units (PFU)/ml of the virulent MDV HPRS-16 strain and turkey herpesvirus (HVT) to 3 log₁₀ PFU/ml of the SB-1 nonpathogenic strain. The sensitivity of the compared PCR was lower by 1–2 log₁₀ PFU/ml. The conducted studies have shown that developed LAMP methods may be used instead of PCR for the detection and differentiation of virulent and nonpathogenic MDV strains used in prophylaxis against MD. LAMP may be conducted without access to thermocyclers.

Nota de Investigación—Comparación de la amplificación isotérmica mediada por gazas y la reacción en cadena de la polimerasa para la detección y diferenciación de los serotipos 1, 2 y 3 del virus de la enfermedad de Marek.

Un estudio llevado a cabo previamente sobre la amplificación isotérmica mediada por gazas (LAMP), demostró su utilidad para la detección de las cepas virulentas de campo del virus de la enfermedad de Marek (MDV). El estudio actual mejoró el método LAMP previamente diseñado mediante un par adicional de iniciadores de gaza, lo que acelera la reacción. También este estudio describe otros dos procedimientos LAMP para la detección específica de la cepa FC126 del virus herpes del pavo y de la cepa no patógena SB-1. Los procedimientos LAMP desarrollados también fueron confirmados y comparados con la PCR. Cada reacción LAMP utilizó tres pares de iniciadores específicos diseñados para detectar las secuencias de nucleótidos de la cepa de Marek muy virulenta, de la cepa SB-1 perteneciente al serotipo 2, y del herpesvirus de pavo, respectivamente. Todas las reacciones LAMP fueron flexibles y proporcionaron resultados confiables en un amplio rango de temperaturas de incubación desde 54.0 a 62.3 C en 15 a 90 min. Los procedimientos LAMP no necesitan de termocicladores, porque todos los ensayos se llevaron a cabo en un baño de agua. La señal de fluorescencia de color verde se registró bajo iluminación ultravioleta en muestras procesadas mediante el procedimiento LAMP que contenían al virus muy virulento de Marek y herpesvirus de pavo y donde se añadió SYBR Green a la mezcla de reacción, mientras que las muestras positivas para el virus SB-1 presentaron iluminación anaranjada después de la tinción con GelRed™. La sensibilidad de las tres reacciones LAMP tuvo un rango desde 2 log₁₀ unidades formadoras de placas (UFP)/ ml para la cepa virulenta HPRS-16 y para el herpesvirus de pavo (HVT) y de hasta 3 log₁₀ UFP /ml para la cepa no patógena SB-1. Por su parte, la sensibilidad de la PCR fue inferior en 1 a 2 log₁₀ UFP/ ml. Los estudi

Results are presented from four studies between 2002 and 2011 into the feasibility of routinely monitoring Marek's disease virus serotype 1 (MDV-1) in broiler house dust using real-time quantitative PCR (qPCR) measurement. Study 1 on two farms showed that detection of MDV-1 occurred earlier on average in dust samples tested using qPCR than standard PCR and in spleen samples from five birds per shed assayed for MDV-1 by qPCR or standard PCR. DNA quality following extraction from dust had no effect on detection of MDV-1. Study 2 demonstrated that herpesvirus of turkeys (HVT) and MDV serotype 2 (MDV-2) in addition to MDV-1 could be readily amplified from commercial farm dust samples, often in mixtures. MDV-2 was detected in 11 of 20 samples despite the absence of vaccination with this serotype. Study 3 investigated the reproducibility and sensitivity of the qPCR test and the presence of inhibitors in the samples. Samples extracted and amplified in triplicate showed a high level of reproducibility except at very low levels of virus near the limit of detection. Mixing of samples prior to extraction provided results consistent with the proportions in the mixture. Tests for inhibition showed that if the template contained DNA in the range 0.5–20 ng/µl no inhibition of the reaction was detectable. The sensitivity of the tests in terms of viral copy number (VCN) per milligram of dust was calculated to be in the range 24–600 VCN/mg for MDV-1, 48–1200 VCN/mg for MDV-2, and 182–4560 VCN/mg for HVT. In study 4 the results of 1976 commercial tests carried out for one company were analyzed. Overall 23.1% of samples were positive for MDV-1, 26.1% in unvaccinated and 16.4% in vaccinated chickens. There was marked regional and temporal variation in the proportion of positive samples and the MDV-1 load. The tests were useful in formulating Marek's disease vaccination strategies. The number of samples submitted has increased recently, as has the incidence of positive samples. These studies provide strong evidence that detection and quantitation of MDV-1, HVT, and MDV-2 in poultry house dust using qPCR is robust, sensitive, reproducible, and meaningful, both biologically and commercially. Tactical vaccination based on monitoring of MDV-1 rather than routine vaccination may reduce selection pressure for increased virulence in MDV-1.

Desarrollo, aplicación y resultados de un muestreo rutinario del virus de la enfermedad de Marek en polvo de casetas avícolas mediante PCR cuantitativo en tiempo real.

Se presentan los resultados de cuatro estudios entre los años 2002 y 2011 sobre la viabilidad de un muestreo para la enfermedad de Marek serotipo 1 (MDV-1) llevado a cabo en polvo de casetas avícolas de pollo de engorde mediante PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR). El estudio 1 llevado a cabo en dos granjas mostró que la detección de MDV-1 en promedio ocurría antes en las muestras de polvo con el método cuantitativo de PCR en comparación con el convencional y en las muestras de bazo de cinco aves por caseta analizadas para detectar al virus de Marek 1 por PCR en tiempo real o por PCR convencional. La calidad del ADN después de la extracción a partir de polvo no tuvo ningún efecto sobre la detección del virus de Marek 1. El estudio 2 demostró que el herpesvirus de pavos (HVT) y el serotipo 2 del virus de Marek (MDV-2), además del serotipo1 podrían ser fácilmente amplificados a partir de muestras de polvo de granjas comerciales, a menudo en mezclas. El serotipo 2 se detectó en 11 de 20 muestras a pesar de la ausencia de la vacunación con este serotipo. El estudio 3 investigó la reproducibilidad y la sensibilidad de la prueba de PCR cuantitativo y la presencia de factores inhibidores en las muestras. Las muestras extraídas y amplificadas por triplicado mostraron un alto nivel de reproducibilidad, excepto a niveles muy bajos del virus que estaban cerca del límite de detección. El mezclado de mue

In spite of the intensive vaccination policy against the Marek's disease virus (MDV) in Egypt, the Egyptian poultry flocks are still suffering from several tumor and paralysis cases. To investigate if MDV is the possible cause, feather follicle and tumor samples were collected during 2011 from 30 vaccinated chicken flocks experiencing nervous signs, emaciation, and tumor lesions. The samples were screened by PCR amplification of the meq full-length gene. Only five of 30 flocks were positive for MDV. Additionally, we sequenced meq from five samples and gL and gC from three samples. A phylogenetic tree was constructed using the deduced amino acid sequences of the meq gene. The sequence analysis revealed that most of the studied sequences showed ≥98% identity to the very virulent European ATE and C12/130 isolates and the very virulent Chinese LMS, YA, WS03, and GX070060 MDV isolates. The two glycoproteins, gL and gC, displayed high similarity to the classical MDV strains published in the database regardless of their virulence.

Caracterización molecular y análisis filogenético del virus de la enfermedad de Marek de casos clínicos en Egipto.

A pesar de la política de vacunación intensiva contra el virus de la enfermedad de Marek (con las siglas en inglés MDV) en Egipto, las parvadas avícolas de este país siguen sufriendo tumores y casos de parálisis. Para investigar si el virus de Marek es la causa, durante el año 2011, se recolectaron muestras de folículos de plumas y de tumores a partir de 30 pollos vacunados que presentaban signos nerviosos, emaciación y lesiones tumorales. Las muestras se analizaron mediante amplificación por PCR del gene meq completo. Sólo cinco de 30 parvadas resultaron positivas para el virus de Marek. Además, se secuenció el gene meq de cinco muestras y a partir de tres muestras, se secuenciaron los genes gL y gC. Se construyó un árbol filogenético usando las secuencias de aminoácidos deducidas del gene meq. El análisis de secuencias reveló que la mayoría de las secuencias estudiadas mostraron ≥ 98% de identidad con los aislamientos muy virulentos europeos ATE y el C12/130 y con los aislamientos muy virulentos de China LMS, YA, WS03, y GX070060. Las dos glicoproteínas, gL y gC, mostraron una similitud mayor a las clásicas cepas de Marek publicadas en la base de datos, independientemente de su virulencia.

A cross-sectional survey was conducted in six provinces in southern Iraq to determine the point prevalence of Marek's disease virus (MDV) in different chicken populations followed by sequencing the meq gene for phylogenetic analysis and virulence-associated polymorphisms. A total of 109 samples from unvaccinated flocks were analyzed comprising 52 dust and 30 spleen samples from commercial broiler farms and 27 spleens from local layer chickens purchased in the town markets. The overall prevalence of MDV was 49.5% with no significant differences between provinces (P  =  0.08) or sample types (P  =  0.89). Prevalence ranged from 36.8% in Karbala and Nasiriyah to 65% in Amarah. The percentages of positive samples were 59.1%, 46.7%, and 48.1% in broiler dust, broiler spleen, and layer spleen, respectively. The overall mean (±SEM) Log₁₀ MDV viral copy number per milligram of dust or spleen as determined by quantitative PCR was 1.78 ± 0.19, with no significant differences between provinces (P  =  0.10) or sample types (P  =  0.38). In positive samples only, the overall mean was 3.43 ± 0.18. Sequencing of the meq gene from samples that showed high levels of MDV target in qPCR testing was attempted. Nine samples were sequenced. These sequences were compared with meq sequences of MDVs of different pathotype. All the Iraqi MDVs had a short meq gene of 897 base pairs because of the deletion of 123 bp relative to the reference strain Md5. The Iraqi meq sequences also contained single-nucleotide polymorphisms, resulting in differences in the amino acid sequence. All of the nine Iraqi meq genes encoded two repeats of four-proline sequences. The published negative association between four-proline repeat number and MDV virulence suggests that the Iraqi MDVs are likely to be highly virulent, but this needs to be confirmed by in vivo testing. Taken together, these results indicate that MDV is common in unvaccinated commercial and village chickens in southern Iraq, that there is limited meq gene sequence variation, that all sequenced samples had a short meq with two four-proline repeats, and that this is consistent with a high level of virulence.

Prevalencia del virus de la enfermedad de Marek en diferentes poblaciones de pollos en Irak e indicaciones de que la virulencia está basada en las variaciones de la secuencia del gene EcoRI-Q (meq).

Se llevó a cabo un estudio transversal en seis provincias del sur de Irak para determinar la prevalencia del virus de la enfermedad de Marek (MDV) en diferentes poblaciones de pollo seguido de la secuenciación del gene meq para el análisis filogenético y de polimorfismos asociados con la virulencia. Se analizaron un total de 109 muestras de las parvadas no vacunadas que incluían 52 muestras de polvo y 30 muestras de bazo procedentes de granjas de engorde comerciales y 27 muestras de bazos de gallinas ponedoras locales adquiridas en los mercados de la ciudad. La prevalencia global del virus de la enfermedad de Marek fue de 49.5%, sin diferencias significativas entre provincias (P  =  0.08) o por tipos de muestras (P  =  0.89). La prevalencia fue de 36.8% en Karbala y Nasiriyah hasta 65% en Amarah. Los porcentajes de muestras positivas fueron de 59.1%, 46.7%, y 48.1% en el polvo de las casetas de pollo de engorde, en los bazos de pollos de engorde, y en los bazos de aves de postura, respectivamente. La media general (± error estándar de la media) del Log₁₀ del número de copias virales del virus de Marek por miligramo de polvo o de bazo

The presence of reticuloendotheliosis virus (REV) was examined in flocks affected with Marek's disease (MD). Sera were positive to REV antibodies by agar gel precipitation. However, these findings were not conclusive since fowlpox vaccines can have REV fragments or the whole genome inserted. Frozen sections from tumors were positive for MD virus (MDV) but negative for REV. Chicken embryo fibroblast (CEF) and chicken kidney cell (CKC) culture inoculated with buffy coat cells or blood from the affected birds were examined. Positive cells were shown for REV and MDV by fluorescent antibodies tests in CEF and CKC, respectively, indicating the presence of REV in Argentinean layer flocks. This is the first report of REV in Argentina and also in South America.

Reporte de Caso—Infecciones mixtas del virus de la enfermedad de Marek y del virus de la reticuloendoteliosis en lotes de aves de postura en Argentina.

Se examinó la presencia del virus de la reticuloendoteliosis (REV) en parvadas afectadas con la enfermedad de Marek. Los sueros fueron positivos a anticuerpos contra el virus de la reticuloendoteliosis mediante precipitación en gel de agar. Sin embargo, estos resultados no son concluyentes ya que las vacunas contra la viruela aviar pueden tener insertados fragmentos o la totalidad del genoma del virus de la reticuloendoteliosis. Los cortes por congelación de los tumores fueron positivos para el virus de Marek, pero negativos para la presencia del virus de la reticuloendoteliosis. Se analizaron cultivos celulares de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) y de riñón de pollo (CKC) inoculados con células de la capa de globulos blancos o con sangre de aves afectadas. Se observaron células positivas para los virus de reticuloendoteliosis y de Marek mediante pruebas de anticuerpos fluorescentes en fibroblastos de embrión de pollo y en células renales de pollo, respectivamente, lo que indica la presencia del virus de la reticuloendoteliosis en lotes de ponedoras argentinas. Este es el primer informe de la presencia del virus de la reticuloendoteliosis en Argentina y también en América del Sur.