Use of real-time PCR is increasing in the diagnosis of infectious disease due to its sensitivity, specificity, and speed of detection. These characteristics make it particularly suited for the diagnosis of viral infections, like avian metapneumovirus (AMPV), for which effective control benefits from continuously updated knowledge of the epidemiological situation. Other real-time reverse transcription (RT)-PCRs have been published based on highly specific fluorescent dye–labeled probes, but they have high initial cost, complex validation, and a marked susceptibility to the genetic variability of their target sequence. With this in mind, we developed and validated a SYBR Green I–based quantitative RT-PCR for the detection of the two most prevalent AMPV subtypes (i.e., subtypes A and B). The assay demonstrated an analytical sensitivity comparable with that of a previously published real-time RT-PCR and the ability to detect RNA equivalent to approximately 0.5 infectious doses for both A and B subtypes. The high efficiency and linearity between viral titer and crossing point displayed for both subtypes make it suited for viral quantification. Optimization of reaction conditions and the implementation of melting curve analysis guaranteed the high specificity of the assay. The stable melting temperature difference between the two subtypes indicated the possibility of subtyping through melting temperature analysis. These characteristics make our assay a sensitive, specific, and rapid tool, enabling contemporaneous detection, quantification, and discrimination of AMPV subtype A and B.
Un método de transcripción reversa y PCR en tiempo real para la detección de Metapneumovirus aviares subtipos A y B sensible, reproducible y económico.
El uso de PCR en tiempo real es cada vez mayor en el diagnóstico de enfermedad infecciosas, debido a su sensibilidad, especificidad y rapidez de detección. Estas características la hacen especialmente adecuada para el diagnóstico de las infecciones virales, como metapneumovirus aviares (aMPV), en donde se facilita el control mediante la constante actualización de la situación epidemiológica. Otras metodologías de transcripción reversa y PCR en tiempo real han sido publicadas con base en sondas altamente específicas marcadas con colorante fluorescentes, pero tienen alto costo inicial, su validación es compleja, y muestran una marcada susceptibilidad de acuerdo con la variabilidad genética de su secuencia blanco. Con esto en mente, se ha desarrollado y validado un método de RT-PCR cuantitativo basado en SYBR Green I para la detección de los dos subtipos aMPV más prevalentes (por ejemplo, los subtipos A y B). El ensayo demostró una sensibilidad analítica comparable con la de un método de RT-PCR en tiempo real publicado previamente y con capacidad de detectar ARN equivalente a aproximadamente 0.5 dosis infecciosas para ambos subtipos A y B. La alta eficiencia y linealidad entre la titulación viral y el punto de cruce para ambos subtipos muestra que el método es adecuado para la cuantificación viral. La optimización de las condiciones de reacción y la aplicación de análisis de la curva de fusión garantiza la alta especificidad del ensayo. La diferencia de temperatura de fusión estable entre los dos subtipos indicó la posibilidad de subtipificación a través del análisis de la temperatura de fusión. Estas características hacen de este ensayo una herramienta sensible, específica y rápida, lo que permite la detección simultánea, la cuantificación y la discriminación de metapneumovirus subtipos A y B.
