Los valores de referencia de hematología y bioquímica sanguínea son claves en la evaluación clínica y en el manejo sanitario de las especies amenazadas y en peligro de extinción. El presente trabajo se llevó a cabo debido a la escasa y dispersa información de este tipo disponible en el caso del oso hormiguero gigante (Myrmecophaga tridactyla). Los ejemplares estudiados (n=30: 16 machos y 14 hembras) son mantenidos en cautiverio en distintas instituciones zoológicas en la Argentina. Los parámetros hematológicos estudiados incluyeron hemograma completo, fórmula leucocitaria e índices hematimétricos (hemoglobina, VCM, HbCM, CHbCM). Los parámetros de bioquímica sanguínea evaluados incluyeron 27 variables. Si bien, en términos generales, los datos relevados de la mayoría de las variables estudiadas presentan diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) con los valores de referencia aportados por la bibliografía, las mismas no parecen ser clínicamente trascendentes. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre sexos a excepción de las determinaciones de lipasa y triglicéridos, siendo el valor mediano de lipasa sérica menor (P=0,0195) y el de trigliceridemia mayor (P=0,0057) en el caso de las hembras.
Introducción
Los valores de hematología y bioquímica sanguínea son indicadores esenciales para llevar a cabo evaluaciones diagnósticas de la salud, tanto a nivel individual como poblacional. El disponer de datos de referencia suministrados por ejemplares sanos de especies silvestres contribuye a la detección temprana de enfermedades individuales y/o disfunciones orgánicas. Los muestreos regulares permiten también evaluar el estado nutricional, prever la presentación de epidemias, evaluar el nivel de impacto de las actividades humanas en las poblaciones silvestres y determinar el estado de salud de los animales en cuarentena o decomisados antes de la reintroducción de los mismos en su hábitat natural (Miranda et al., 2007; Barnes et al., 2008; Superina & Mera y Sierra, 2008; Superina et al., 2010).
El oso hormiguero gigante (Myrmecoyhaga tridactyla) es un mamífero nativo de la región neotropical que pertenece al orden Pilosa, familia Myrmecophagidae (Gardner, 2008). Se distribuye desde Belice y sur de Guatemala hasta el norte de Argentina (Eisenberg & Redford, 1999). Esta especie es considerada “Vulnerable” tanto a nivel internacional (IUCN, 2014) como para el territorio argentino (Superina et al., 2012). Dentro de las causas principales de amenaza se encuentran el avance antrópico, la degradación de su ambiente, el atropellamiento por automóviles, los fuegos espontáneos o intencionales, la alta presión cinegética y la baja capacidad de fuga (Silveira et al., 1999; Fonseca & Aguiar, 2004; Superina et al., 2010). Otros aspectos relevantes que pueden afectar su supervivencia son la alta especialización en la dieta, la baja tasa reproductiva y el cuidado prolongado que requieren sus crías (Miranda, 2012).
Desafortunadamente, los valores de referencia de hematología y bioquímica sanguínea en M. tridactyla son escasos y dispersos a nivel internacional y casi nulos a nivel nacional. El propósito del presente estudio fue proporcionar valores de hematología y bioquímica sanguínea locales provenientes de ejemplares de M. tridactyla mantenidos en cautiverio en Argentina como una contribución al conocimiento y a la conservación de la especie.
Materiales y Métodos
Colecta de muestras
Durante los meses de septiembre de 2007 y marzo de 2009 se colectaron muestras de 30 ejemplares de oso hormiguero (16 machos y 14 hembras) mantenidos en cautiverio en distintas instituciones zoológicas de Argentina ( Tabla 1 ).
Las muestras de sangre (10 ml en total) se recogieron de la vena safena externa usando agujas estériles calibre 21–23 G (Neojet, Zhejiang, China). Una alícuota (1 ml) se colocó en tubos que contenían etilendiaminotetraacetato de calcio (EDTA) como anticoagulante para muestras de hematología y el resto se recogió en tubos secos sin anticoagulante, separándose el suero por centrifugación (1.500 rpm; CH 2036, Rolco, Buenos Aires, Argentina). Se realizaron extendidos de sangre fresca, los cuales se secaron al aire y se guardaron en recipientes para tal fin.
Para la extracción de las muestras, los animales fueron inmovilizados químicamente mediante la utilización de 4 mg/kg tiletamina-zolazepam (Zelazol, Fort Dodge, Iowa, USA) por vía intramuscular (i.m.) (Deem & Fiorello, 2002) o con una combinación de 10 mg/kg ketamina (Ketonal 100, Richmond Vet Pharma, Buenos Aires, Argentina), 0,5 mg/kg xilacina (Xilacina 100, Richmond Vet Pharma, Buenos Aires, Argentina) y 0,2 mg/kg butorfanol i.m. (Butormin, Holliday-Scott, Beccar, Argentina). Las dosis de anestesia fueron calculadas en base a la estimación del peso corporal de cada individuo. Los animales fueron inyectados con una jeringa de mano o con cerbatana (Telinject blowpipe system, California, USA). Durante la inmovilización los animales se sometieron a un examen físico completo el que se complementó, en algunos casos, con estudios de ultrasonografía y ecocardiografía, lo que permitió considerarlos como clínicamente sanos al momento del muestreo. La totalidad de los animales estudiados fueron testeados serológicamente para brucelosis utilizando la técnica de aglutinación con antígeno buferado en placa (BPA) (Nicola & Elen, 2009) y para ocho serovares de leptospirosis mediante el test de aglutinación microscópica (MAT) (Faine et al., 1999) con resultado negativo para ambos procedimientos (Marc et al., 2009).
Determinaciones hematológicas y de bioquímica sanguínea
El recuento de eritrocitos fue realizado con un contador hematológico de tecnología láser SYSMEX XS 1000i (Sysmex America Inc., Mundelein, EEUU). Para la determinación del hematocrito (packed cell volume — PCV) las muestras de sangre se centrifugaron en una centrífuga de microhematocrito (CH 24, Rolco, Buenos Aires, Argentina) durante cinco minutos a 10.000 rpm, efectuándose la medición de PCV por lector de microhematocrito automático. La hemoglobina (Hb) se determinó por método espectrofotométrico y la fórmula leucocitaria relativa sobre extendidos coloreados con May Grünwald-Giemsa. Con los valores de PCV y Hb se realizó el cálculo de los índices hematimétricos: volumen corpuscular medio (VCM), hemoglobina corpuscular medio (HbCM) y concentración de hemoglobina corpuscular medio (CHbCM).
Los análisis del suero para bioquímica sanguínea se realizaron con Autoanalizador Clínico Metrolab 2300 plus Random Access Clinical Analyzer (UV-Vis Metrolab S.A., Buenos Aires, Argentina) y kits comerciales (Wiener Lab, Rosario, Argentina) siguiendo las indicaciones del fabricante y utilizando las soluciones blanco y estándar para calibración proporcionadas por el mismo. Las determinaciones realizadas incluyeron: alanina aminotransferasa (ALT/GPT), aspartato aminotransferasa (AST/GOT), gamma glutamil transferasa (GGT), lactato deshidrogenasa (LDH), fosfatasa alcalina (ALP), creatina fosfoquinasa (CPK), amilasa y urea (método cinético); calcio (Ca), fósforo (P), hierro (Fe), magnesio (Mg), bilirrubina total, bilirrubina directa, proteínas totales y albúmina (método colorimétrico); globulinas (concentración de proteína total menos la concentración de albúmina); creatinina (Jaffé método colorimétrico); lipasa, colesterol, triglicéridos y ácido úrico (método enzimático). Sodio (Na), potasio (K) y cloro (Cl) se midieron por método directo con electrodo de ión selectivo (Ciba-Corning 614 Electrolytes Analyzer, Ciba-Corning, Halstead, Inglaterra) y fibrinógeno (manualmente mediante inmunodifusión radial, Biocientífica S.A., Bs.As., Argentina).
TABLA 1.
Descripción de ejemplares de Myrmecophaga tridactyla muestreados en el presente estudio incluyendo sexo, edad, origen, institución y protocolo anestésico utilizado. ZFV: Zoológico Florencio Varela); EFA: Estación de Fauna Autóctona, Salta; JZLP: Jardín Zoológico y Botánico de La Plata; TMK: Fundación Temaikèn; RZP: Complejo Ecológico Municipal de Roque Sáenz Peña (Presidencia Roque Sáenz Peña). T/Z: tiletamina-zolazepam; K/X/B: ketamina/xilacina/butorfanol. Sgo. Est: Santiago del Estero; Sta. Fe: Santa Fe.
Análisis de los datos
Los datos analizados corresponden al total de los individuos evaluados. Dado que algunas de las variables estudiadas no presentan distribución normal y a los efectos de uniformar la estrategia de análisis, la comparación entre sexos se llevó a cabo con la prueba no paramétrica U de Mann Whitney que compara los valores medianos. La comparación entre sexos de los valores de cloro se llevó a cabo con la prueba no paramétrica de rangos con signo de Wilcoxon para una única muestra, donde el valor mediano de la variable en estudio correspondiente a los machos (sexo más numeroso) se comparó con el valor mediano calculado a partir de los únicos tres datos disponibles para las hembras. Para las comparaciones con los valores informados en la bibliografía se utilizaron los valores totales en aquellos casos en que la diferencia entre sexos era no significativa. En estos casos no fue posible establecer comparaciones entre los valores medianos dado que los valores aportados por la literatura corresponden a valores promedio. Para ello se probó la normalidad de las variables en estudio. En aquellos casos en que se rechazó la hipótesis de normalidad (% eosinófilos), las conclusiones deben considerarse sólo como orientativas. Las comparaciones entre el valor promedio de cada variable relevada en los animales muestreados y los valores promedio de referencia se llevaron a cabo con la prueba t de Student aplicable al caso de una única muestra (Sheskin, 2011).
Resultados
La exhaustiva revisación clínica, acompañada en algunos casos con estudios complementarios, sumado al resultado negativo de las determinaciones serolóogicas de brucelosis y leptospirosis permitió considerar que todos los animales incluidos en el presente estudio tenían buen estado de salud y buena condición corporal (peso corporal promedio+desvío estándar: machos: 44,0+7,87 kg; hembras: 39,8+3,75 kg). La Tabla 1 detalla el sexo, la edad, el origen, la institución y el protocolo anestésico utilizado correspondientes a cada uno de los ejemplares muestreados. Las Tablas 2 y 3 resumen los valores de hematología y bioquímica sanguínea, respectivamente. A excepción de las determinaciones de lipasa que fue menor en las hembras (P=0,02) y de triglicéridos que fue menor en los machos (P=0,006), no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre sexos (P>0,05) en las variables relevadas. El valor mediano de Hb tendió a ser mayor en los machos sin alcanzar el significado estadístico (P=0,064).
La confrontación de los valores de hematología y bioquímica sanguínea obtenidos con los suministrados por la bibliografía se detalla en las Tablas 4 y 5 , respectivamente. En todos los casos, al menos uno de los contrastes con los valores publicados mostró significado estadístico (P<0,05).
Discusión
La disminución del número de osos hormigueros gigantes de vida libre ha puesto de relieve la importancia del mantenimiento de sus poblaciones cautivas (Knott et al., 2013). Tales poblaciones presentan problemáticas particulares vinculadas, entre otras, con la reproducción de la especie fuera de su hábitat natural y el mantenimiento de la diversidad genética (Collevatti et al., 2007) así como con la preservación de su estado sanitario. Para monitorear el estado sanitario de los individuos cautivos, así como la de aquellos que se incorporan por diversas razones a la vida en cautiverio, se requiere disponer de valores de referencia para las variables involucradas.
Si bien existen reportes de algunos valores del perfil hematológico y bioquímico sérico del oso hormiguero gigante (Rosenfeld & Hoehne, 1953; Ruempler, 1995; Satake, 2002; Mussart et al., 2006; Neves Junior et al., 2006; ISIS, 2013; Sanches et al., 2013) los mismos no sólo no son abundantes sino que además son variables. Esta escasez dificulta la interpretación de los exámenes, pudiendo dar como resultado diagnósticos indeterminados o incorrectos (Sanches et al., 2012).
La comparación de los valores relevados en este estudio con aquellos aportados por la bibliografía se ve dificultada por las diferencias entre las modalidades de muestreo y las técnicas analíticas empleadas, muchas de las cuales no son informadas en los reportes bibliográficos. En este sentido los datos obtenidos a partir del International Species Information System (ISIS, 2013) resultan de suma utilidad por basarse en un importante número de muestras procesadas, aunque al tratarse de una base de datos producto de la colaboración de una gran cantidad de instituciones presenta amplia heterogeneidad en lo relativo a la metodología de muestreo y análisis.
La ausencia de dimorfismo sexual tanto para los indicadores hematológicos como para aquellos vinculados con la bioquímica sanguínea ( Tablas 2 y 3 ) son coincidentes con el único reporte que informa comparaciones entre sexos para dichas variables (Satake, 2002).
Este estudio aporta el primer reporte de fibrinógeno para esta especie. Al confrontarlo con valores disponibles para otros xenartros como el armadillo de nueve bandas Dasypus novemcintus 460+210 mg/ dl (Prejean & Travis, 1971) y el peludo Chaetophractus villosus 209+70 mg/dl hembras / 380+100 mg/dl machos (Polini & Casanave, 1999) se observaron diferencias significativas (P<0,05), siendo los valores informados en la literatura menores al observado por los autores. La importancia clínica de establecer valores normales de fibrinógeno radica que un aumento de éste puede estar relacionado con procesos inflamatorios y la disminución con falla hepática o coagulopatías (Borges et al., 2007; Brooks, 2008). En este último sentido está bien documentada la predisposición de la especie a presentar hemorragias por hipovitaminosis K (Diniz et al., 1995; Morford & Meyers, 2003a).
Tabla 2.
Valores de hematología de M. tridactyla para sexos combinados y para machos y hembras por separado. Hb: hemoglobina; VCM: volumen corpuscular medio; HbCM: hemoglobina corpuscular medio; CHbCM: concentración de hemoglobina corpuscular medio.
Tabla 3.
Valores de bioquímica sanguínea de Myrmecophaga tridactyla para sexos combinados y para machos y hembras por separado. ALT: alanina aminotransferasa; AST: aspartato aminotransferasa; GGT: gamma glutamil transferasa; LDH: lactato deshidrogenasa; CPK: creatina fosfoquinasa.
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Tabla 4.
Valores de hematología de Myrmecophaga tridactyla para sexos combinados obtenidos en el presente estudio versus los aportados por la bibliografía. † Animales de vida libre; * animales de cautiverio. Hb hemoglobina; VCM: volumen corpuscular medio; HbCM: hemoglobina corpuscular medio; CHbCM: concentración de hemoglobina corpuscular medio. a,b: diferencias entre los valores que no comparten el mismo superindice son significativas en al menos 0,05.
Tabla 5.
Valores de bioquímica sanguínea de Myrmecophaga tridactyla para sexos combinados obtenidos en el presente estudio versus los aportados por la bibliografía. † Animales de vida libre; * animales de cautiverio. ALT: alanina aminotransferasa; AST: aspartato aminotransferasa; GGT: gamma glutamil transferasa; LDH: lactato deshidrogenasa; CPK: creatina fosfoquinasa. a,b diferencias entre los valores que no comparten el mismo superindice son significativas en al menos 0,05.
Debe tomarse en consideración que la implementación de este tipo de estudios en animales silvestres implica un inevitable estrés provocado por el manejo, la restricción física derivada de su captura y la utilización de drogas anestésicas que pueden promover diferentes grados de alteración en el cuadro hematológico y bioquímico sérico, dependiendo de la respuesta fisiológica de cada especie e individuo a esos estímulos (Kuttner & Wiesner, 1987; Rietkerk et al., 1994; Huber et al., 1997; Vogel et al., 1999; Kusak et al., 2005). La contracción esplénica provocada por el estrés de la captura puede provocar un aumento del PCV y plaquetas (Barnes et al., 2008). Por el contrario, la administración de anestésicos puede reducir el número de eritrocitos circulantes debido a una disminución en la presión sanguínea y al secuestro esplénico (Satake, 2002).
Otras alteraciones hematológicas provocadas por la liberación de corticoides endógenos son la neutrofilia, eosinopenia y linfopenia (leucograma por estrés). Estudios realizados en diferentes animales silvestres sometidos a captura en vida libre presentan actividades séricas de AST, ALT y CPK comparativamente mayores a las registradas en animales de cautiverio (Kuttner & Wiesner, 1987; Huber et al., 1997; Constable et al., 1998; Vié et al., 1998). La misma tendencia se observa en este estudio al comparar los resultados provenientes de dichas determinaciones con los valores bibliográficos originados en ejemplares de vida libre. El incremento de la actividad sérica de AST, ALT y GGT fue documentada en esta especie como marcador de disfunción hepática (Hatt et al., 1998) y el aumento de CPK en afección del miocardio (Coke et al., 2002). Los niveles de bilirrubina deben determinarse en conjunto con AST, ALT y GGT con el fin de evaluar daño hepatocelular o de función hepática.
Urea, creatinina, acido úrico y P son utilizados como indicadores de funcionalidad renal. Su incremento en sangre puede estar influenciado por niveles postprandiales debido a elevadas cantidades de proteína en la dieta o por la reducción en la excreción urinaria a causa de estados de deshidratación, insuficiencia renal, obstrucción de las vías urinarias o disminución del flujo sanguíneo a través del riñón (Gleadhill & Mitchell, 1999). En este sentido, las pequeñas variaciones que se presentaron de urea, creatinina y acido úrico podrían estar relacionadas al estado de hidratación por los diferentes períodos de ayunos de líquidos entre el presente trabajo y la bibliografía. Las enfermedades hepáticas y renales suelen ser reportadas de manera asociada (Morford & Meyers, 2003a) y se presentan como unas de las patologías con mayor relevancia en cuanto a mortalidad de osos hormigueros en cautiverio (Diniz et al., 1995; Morford & Meyers, 2003a; Miranda et al., 2004). La diferencia estadística expresada en marcadores de funcionalidad hepática (AST, ALT, GGT, LDH, ALP, bilirrubina) y funcionalidad renal (creatinina, urea, acido úrico, P; Tabla 5 ) no implica necesariamente un significado clínico.
Otro aspecto de importancia a considerar es el manejo nutricional al que son sometidos estos animales en cautiverio, en tanto la dieta que se les ofrece difiere notoriamente de la consumida en la naturaleza (Redford, 1985). Como consecuencia los ejemplares cautivos presentan en muchas ocasiones enfermedades asociadas a una inadecuada nutrición (Diniz et al., 1995; Morford & Meyers, 2003a; Miranda et al., 2004). La incidencia directa de la nutrición sobre los valores observados en este estudio no pudo ser evaluada ya que las dietas consumidas por los animales participantes del estudio fueron muy heterogéneas. A pesar de ello, se considera que los valores obtenidos son representativos debido a que, hasta el momento, no se dispone de un consenso respecto de la dieta ideal para osos hormigueros y, por lo general, cada institución zoológica adopta una dieta diferente (Trusk et al., 1992; Ward et al., 1995; Morford & Meyers, 2003b; Di Nucci, 2007). Las variables que se podrían vincular con condiciones relacionadas directamente a la dieta, incluyen a los macrominerales (Ca, P, Mg, Cl, Na, K, Fe), proteínas totales, albúmina, triglicéridos, colesterol e indirectamente a diferentes marcadores relacionados con la funcionalidad digestiva (amilasa, lipasa, marcadores de la funcionalidad hepática). En este sentido, el hierro difiere con el único valor bibliográfico, lo cual podría asociarse directamente con la cantidad del mismo que es aportado en la dieta, proviniendo principalmente de los alimentos balanceados comerciales utilizados (para caninos o felinos domésticos).
Conclusiones
Se reportan por primera vez valores de fibrinógeno y 13 de 40 variables analizadas se informan por primera vez para el medio local, convirtiendo a esta comunicación en el estudio más completo sobre el tema para Argentina. En este sentido, los valores locales pueden ser considerados como un aporte de utilidad tanto para la evaluación del estado de salud-enfermedad como así también para garantizar el bienestar animal de las poblaciones silvestres y en cautiverio. Esta condición de bienestar es un pilar indispensable para el mantenimiento en cautividad de la especie, ya sea como integrantes de una población estable de una institución zoológica o como parte de un programa de conservación ex situ.
Agradecimientos
Este trabajo se desarrolló bajo el Programa de Becas de Promoción de las Actividades Científicas y Tecnológicas (Res C.D. N° 175/03), convocatoria año 2007, Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de Rosario (Argentina).
A las siguientes instituciones por su colaboración y predisposición para muestrear a sus ejemplares para este estudio: Proyecto de Conservación Oso Hormiguero Gigante (Myrmecophaga tridactyla), Artis Royal Zoo (Ámsterdam, Holanda) — Zoológico Florencio Varela (Arg); Conservation Land Trust Argentina; Estación de Fauna Autóctona (EFA) - Secretaría de Medio Ambiente y Desarrollo Sustentable de la Provincia de Salta; Jardín Zoológico y Botánico de La Plata (La Plata, Prov. Buenos Aires); Fundación Temaikèn (Belén de Escobar, Prov. Buenos Aires); Complejo Ecológico Municipal de Roque Sáenz Peña (Presidencia Roque Sáenz Peña, Prov. Chaco). A la Fundación Wiener Laboratorios por la donación de los kits comerciales (Wiener Lab, Rosario, Argentina). A Mariella Superina y a los dos revisores anónimos por sus importantes aportes y correcciones que ayudaron a mejorar el manuscrito.
